|
|
|
Raport de Cercetare
EFECTUL BLOCAJULUI BETA ADRENERGIC AL PROPRANOLOLULUI ASUPRA MORFOLOGIEI AXULUI HIPOTALAMO-HIPOFIZO-CORTICOSUPARENALIAN SI ASUPRA UNOR INDICI METABOLICI IN CONDITIILE TRATAMENTULUI EPICUTN CU FLUOCINOLON-ACETONID N
Functiile organismului sunt reglate prin doua mari sisteme de control: sistemul nervos, prin intermediul caruia are loc o transmitere rapida a mesajelor si sistemul endocrin, prin care mesajele ajung mai lent, dar manifesta un efect de durata. Intre aceste sisteme de reglare fundamentale exista corelatii morfofunctionale, sistemul nervos controleaza activitatea sistemului endocrin, care la randul lui influenteaza dezvoltarea si activitatea sistemului nervos. Controlat de sistemul nervos central si la randul sau influentand activitatea nervoasa superioara, sistemul endocrin exercita multiple si complexe functii care contribuie la mentinerea homeostaziei mediului intern, necesara pentru buna functionare a proceselor biochimice celulare.
Mentinerea homeostaziei organismului animal si uman necesita o adaptare comportamentala, vegetativa si endocrina continua pentru contracararea cat mai eficienta a efectelor negative ale factorilor externi si interni, care tind sa modifice permanent echilibrul organismului. Raspunsul major al organismului fata de actiunea factorilor de stres este activarea axului hipotalamo-hipofizo-corticosuprarenalian (HHC), care consta in eliberarea rapida de corticoliberina, respectiv adrenocorticotropina (ACTH), urmata imediat de cresterea concentratiei plasmatice de glucocorticoizi. Corticoliberina sintetizata de nucleul paraventricular (NPV) din hipotalamus, are rol determinant atat in raspunsul axului fata de factorii de stres cat in cel al sistemului nervos autonom. Secretia neurohormonului cat si a ACTH este influentata atat de mediatori chimici cat si de neuropeptide. Neuronii hipotalamici din NPV si supraoptic prezinta inervatie adrenergica si noradrenergica bogata. Ca urmare atat neuronii hipotalamici cat si celulele hipofizare prezinta receptori β-adrenergici. Modificarea activitatii acestor receptori in conditii de stres determina modificarea activitatii secretorii a axului HHC. Datele experimentale si clinice arata ca modificarile endocrine-metabolice induse de dermocorticoizi se datoreaza in mare parte activarii receptorilor β-adrenergici.
Alterarea morfofunctionala a axului HHC determina dereglarea echilibrului hormonal, datorita faptului ca, prin intermediul hipotalamusului si al hipofizei glucocorticoizii pot influenta si activitatea altor glande endocrine periferice, nu numai a suprarenalei. Acest dezechilibru hormonal, la randul lui, determina modificarea metabolismului intermediar, ceea ce duce la dereglari functionale ale intregului organism.
Excesul de cortizol la om determina efecte catabolice (hipotrofia musculaturii proximale a membrelor, subtierea tegumentara, fragilitate vasculara, osteoporoza) gluconeogenetice si antiinsulinice (hiperglicemie, scaderea tolerantei la glucoza sau diabet zaharat secundar) de inhibare asupra eliberarii si actiunii periferice a hormonului de crestere. Produce, de asemenea inhibarea eliberarii de gonadotropi, psihoze maniaco-depresive si imunosupresie.
Dermocorticoizii sunt larg utilizati in tratamentele dermatologice datorita proprietatilor lor antiinflamatoare si antiproliferative. Efectele topice benefice sunt bine cunoscute, dar efectele secundare locale si sistemice de risc, cauzate prin absorbtia transcutana a acestora, sunt mai putin elucidate, ceea ce limiteaza utilizarea lor si constituie un argument pentru continuarea cercetarilor.
Fluocinolon crema si unguent, respectiv Fluocinolon-acetonid N crema si unguent, sunt larg utilizate in tara noastra datorita actiunilor antiinflamatoare, antipruritice si antialergice. Cu toate ca normalizeaza procesul de keratinizare, exista date experimentale care arata ca utilizat un timp mai indelungat, chiar si in cantitati minime, produce efecte secundare locale. Chiar prospectele care insotesc medicamentele contraindica utilizarea acestor produse la gravide sau, daca totusi se utilizeaza, apare indicatia sa fie aplicate pe o suprafata de mica intindere, in cantitate nu prea mare si pe o durata limitata.
Cu toate ca actiunea permisiva a glucocorticoizilor in efectele endocrino-metabolice diabetogene ale adrenalinei endogene este clarificata din mai multe puncte de vedere la sobolanul alb, se cunoaste foarte putin in ceea ce priveste implicatiile activarii receptorilor β-adrenergici de catre adrenalina circulanta in procesele endocrino-metabolice induse de excesul glucocorticoidic de origine endogena sau exogena.
Pornind de la aceste considerente si de la observatiile noastre recente conform carora absorbtia transcutana a unor glucocorticoizi superpotenti halogenati sau nehalogenati determina aparitia unor efecte sistemice secundare adverse, de risc, in lucrarea de fata am investigat influenta blocarii receptorilor β-adrenergici cu Propranolol asupra mecanismului de actiune endocrino-metabolica a unguentului Fluocinolon-acetonid N.
Animalele de experienta au fost repartizate in urmatoarele loturi:
lotul M1-animale prepubere netratate-martor;
lotul M2 -animale pubere netratate-martor;
lotul FC1-animale prepubere tratate cu Fluocinolon-acetonid N;
lotul FC2-animale pubere tratate cu Fluocinolon-acetonid N;
lotul PR+FC1-animale prepubere tratate cu Fluocinolon-acetonid N pe fondul administrarii de Propranolol;
lotul PR+FC2-animale pubere tratate cu Fluocinolon-acetonid N pe fondul administrarii de Propranolol.
Fragmentele de hipotalamus, adenohipofiza si corticosuprarenala prelevate au fost prelucrate in vederea efectuarii studiilor histologice si de microscopie electronica. Evidentierea neuronilor secretori din hipotalamus s-a efectuat cu metoda de colorare Kluver-Barerra, celulele adenohipofizare au fost identificate cu metoda de colorare Hurduc si colab. Corticosuprarenala a fost colorata cu hematoxilina-eozina.
Cantitatea de glucoza sanguina a fost determinata enzimatic cu God-Perid-Glucose Kit. Colesterolul seric a fost dozat cu micrometoda fotocolorimetrica a lui Zlatkis si colab., cantitatea acizilor grasi liberi (AGL) din serul sanguin a fost determinata cu ajutorul metodei lui Chernick si Novak , trigliceridele totale si lipidele totale serice au fost dozate cu Kit-Boehringer. Fosfataza alcalina a fost determinata cu ajutorul metodei lui Besse -Lowry. Fosfataza acida s-a determinat prin metoda Bergmeyer. Transaminazele au fost determinate colorimetric.
Greutatea relativa a timusului, suprarenalelor si splinei a fost calculata si exprimata in mg/100 g animal dupa izolarea si cantarirea rapida a acestora cu balanta de torsiune.
Dinamica ritmului de crestere in greutatea corporala a indivizilor a fost evaluata procentual (in g%) pe baza modificarii fata de initial (prima zi de tratament) a greutatii corporale inregistrate la 24 de ore dupa sistarea tratamentelor cu FC, repectiv cu PR+FC.
Rezultatele structurale
La lotul FC1 si FC2, atat neuronii parvocelulari cat si cei magnocelulari apar modificati. In primul rand, se observa o usoara crestere a numarului neuronilor activi din zona parvocelulara. Se observa o usoara acumulare a neuropeptidelor in pericarionul celular atat in neuronii parvocelulari cat si in cei magnocelulari. Corpul celular si nucleii neuronilor secretori de CRH (corticoliberina) sunt usor hipertrofiati, ceea ce arata ca excesul de glucocorticoizi determina o inhibare a eliberarii neurosecretiilor la nivelul terminatiilor nervoase din eminenta mediana.
Acest mod de actiune a glucocorticoizilor in conditiile experimentului nostru am putea explica, fie prin actiunea directa a stimularii circuitului neuronal noradrenergic locus coeruleus-NPV- sistemul limbic-nucleii hipotalamici, fie prin actiunea indirecta a acestuia, constand in intensificarea eliberarii vasopresinei din neuronii magnocelulari ai NPV. In primul caz excesul glucocorticoidic ar putea determina activarea simpaticului, ceea ce are ca rezultat intensificarea descarcarii de noradrenalina si in consecinta intensificarea activitatii neurosecretorii din nucleii hipotalamici.
In al doilea caz, excesul glucocorticoidic ar putea determina stimularea neuronilor secretori de vasopresina (VP). VP poate stimula atat activitatea secretorie din NPV cat si activitatea secretorie a ACTH de la nivelul celulelor corticotrope. Datele din literatura arata ca VP eliberata de nucleul supraoptic, pe de o parte determina activarea neuronilor secretori de corticoliberina in mod paracrin, iar pe de alta parte ajunge prin fibrele nervoase ale tractului supraoptico-infundibular in eminenta-mediana, de unde pe cale sangvina este descarcata in adenohipofiza.
La lotul PR+FC1 si PR+FC2, NPV prezinta un aspect apropiat lotului martor. Neuronii secretori se afla in diferite faze ale activitatii secretorii. Numarul neuronilor activi este mai mare comparativ cu loturile tratate cu Fluocinolon, dar mai redus comparativ cu loturile martor. Aceste rezultate arata ca propranololul determina o normalizare a activitatii secretorii a nucleilor hipotalamici.
Adenohipofiza la lotul M1 si M2 prezinta aspectul citoarhitectonic normal caracteristic glandei, principalele tipuri celulare - respectiv celulele acidofile sunt colorate in diferite nuante de rosu-caramiziu, celulele bazofile prezinta nuante de albastru sau albastru-violaceu, celulele gama sunt de culoare albastru-azur, iar celulele cromofobe sunt incolore. La animalele normale exista un raport specific intre celulele adenohipofizare, constant intr-o anumita faza a dezvoltarii ontogenetice sau in diferite faze ale activitatii diurne sau sezoniere.
Examenul histologic al adenohipofizei la loturile FC1 si FC2 releva modificari structurale atat ale celulelor acidofile cat si ale celor bazofile, in comparatie cu loturile de control. Apare un numar mare de celule bazofile balonizate, citoplasma lor avand o structura spumoasa, puternic vacuolizata, caracteristica celulelor Crooke. Celulele acidofile, mai ales celulele somatotrope prezinta o structura modificata, (rosu-caramiziu), fiind usor hipertrofiate.
Aceste rezultate sunt in concordanta cu rezultatele studiului gravimetric. Scaderea ritmului de crestere are la baza intensificarea catabolismului proteic. Rezultatele noastre anterioare demonstreaza ca excesul glucocorticoidic afecteaza grav structura si ultrastructura celulelor somatotrope si gonadotrope, celule cu rol deosebit de important in cresterea si dezvoltarea organismului tanar. Date din literatura arata ca excesul glucocorticoidic provocat de administrarea de glucocorticoizi, reduce semnificativ concentratia sangvina a hormonilor adenohipofizari: somatotrop (STH) si gonadotrop (GTP).
Adenohipofiza la loturile PR+FC1 si PR FC2 prezinta un aspect apropiat loturilor martor, dispar celulele Crooke, ceea ce arata ca agentul β-blocant anuleaza efectele adrenergice ale surplusului glucocorticoidic.
Corticosuprarenala la lotul M1 si M2 prezinta aspectul normal caracteristic glandei .
La loturile FC1 si FC2, suprarenala prezinta o corticala mult redusa in comparatie cu loturile martor. In zona glomerulara apar celule hiperplazice, iar zona fasciculata prezinta o structura compacta, mult mai accentuata comparativ cu loturile netratate. Ea este mai ingusta in comparatie cu martorul, spatiile intercelulare lipsesc. Spongiocitele caracteristice acestei zone lipsesc, ceea ce sugereaza o inhibare completa a procesului de sinteza a glucocorticoizilor.
La loturile PR+FC1 si PR+FC2, suprarenala prezinta un aspect apropiat de cel inregistrat la loturile martor. In zona fasciculata sunt prezente spongiocitele, ceea ce arata ca sub actiunea agentului β-blocant se reduc efectele negative ale excesului glucocorticoidic si la nivelul corticosuprarenalei.
Atat rezultatele noastre cat si cele din literatura arata ca excesul glucocorticoidic determina reducerea volumului zonei fasciculate. Atrofierea suprarenalei poate fi explicata prin modificarea activitatii secretorie a celulelor hipofizare adrenocorticotrope. Dupa cum se stie efectul metabolic principal al glucocorticoizilor este cresterea glicemiei. Datele din literatura arata ca hiperglicemia determina activarea neuronilor secretori de somatostatina. Efectul atrofiant al excesului glucocorticoidic poate fi explicat si prin inhibarea sintezei factorilor de crestere de catre somatostatina, factori care in conditii fiziologice normale determina intensificarea proliferarii si diferentierii celulelor matca din capsula conjunctiva a glandei. Tratamentul cu propranolol determina probabil, reducerea activarii receptorilor β-adrenergici de la nivelul neuronilor secretori de somatostatina, ceea ce are ca rezultat activarea secretiei factorilor de crestere, reducind semnificativ atrofierea suprarenalelor.
In conditii normale ACTH intensifica captarea colesterolului din lipoproteinele cu densitate mica, dupa care colesterolul este esterificat si depozitat in citoplasma sub forma de picaturi lipidice. Prin actiunea colesterol-hidrolazei, din colesterolul esterificat se desprinde colesterolul liber. Un caraus proteic il transporta in mitocondrii unde sub actiunea colesterol-dezmolazei se transforma in pregnenolon. Pregnenolonul trece in reticolul endoplasmic neted si printr-un proces de dehidrogenare formeaza progesteronul. Progesteronul sub actiunea enzimei 17 α hidroxilaza se transforma in cortizol (respectiv in corticosteron la sobolani). In conditiile investigatiilor noastre desi ultastructura celulelor corticotrope este aproape normala, absenta totala a picaturilor lipidice din celulele zonei fasciculate din corticosuprarenala sugereaza inca o data o eventuala blocare a eliberarii de ACTH. Datorita acestui fapt nu are loc captarea colesterolului, mai mult este alterat echipamentul enzimatic raspunzator de sinteza steroizilor, ceea ce determina depletia totala de lipide. In absenta sintezei hormonale creste concentratia colesterolului seric, fapt demonstrat si de alti cercetatori. Aceste observatii concorda cu datele din literatura care arata ca sub actiunea dexametazonei la cobai are loc o reducere a reticolului endoplasmic neted, al aparatului Golgi precum si a mitocondriilor din zona fasciculata a corticosuprarenalei cu rol in elaborarea si eliberarea granulelor de secretie de natura lipidica. Tratamentul cu propranolol determina inactivarea receptorilor β-adrenegici si deblocarea eliberarii ACTH, ceea ce are ca rezultat intensificarea sintezei hormonale in celulele zonei fasciculate.
Rezultate ultrastrucutrale
La microscopul electronic se poate evidentia modul de dispunere a celulelor somatotrope care in general apar in apropierea celulelor gonadotrope si corticotrope, avand un pol situat spre capilarele sanguine. Celulele STH la lotul martor au nucleul ovalar, predominant eucromatic, heterocromatina fiind repartizata la periferia nucleului intr-un strat subtire si din loc in loc in cateva blocuri mai mari. In citoplasma se observa prezenta a numeroase granule electrondense sferice avand dimensiuni cuprinse intre 350-400 nm. Mitocondriile sunt alungite si dispuse in grupuri, complexul Golgi apare in vecinatatea nucleului, alcatuit din saci aplatizati, care la multe celule sunt aranjati sub forma de potcoava. In zona trans a sacilor aplatizati exista numeroase microvezicule, ceea ce semnifica intensa activitate de elaborare si eliberare de granule de secretie de natura hormonala.Reticolul endoplasmic este reprezentat de profile inguste, dispuse de regula in jurul nucleului dar si intre mitocondrii si granule de secretie. In matricea citoplasmica se gasesc mai multi sau mai putini ribozomi in functie de starea de activitate a celulei.
Forma celulelor ACTH este poligonala, caracteristica principala a acestor celule fiind dispozitia granulelor de secretie pe un singur rand de-a lungul membranei celulare. Dimensiunea granulelor este de aproximativ 200 nm. Nucleul este ovalar fiind situat in axul longitudinal al celulelor, are un nucleol evident, iar heterocromatina este dispusa in blocuri electrondense imprastiate in masa carioplasmei, precum si intr-o pelicula foarte fina la periferia membranei nucleare. Citoplasma este de electrondensitate medie continand mitocondrii de forma alungita, relativ putine profile de reticol endoplasmic si ribozomi raspanditi in toata matricea citoplasmica. Aceste organite celulare in unele celule sunt mai mult sau mai putin numeroase in functie de ciclul de secretie al celulei.
Studiile ultrastructurale privind actiunea dermocorticoidului Fluocinolon-acetonid N asupra celulelor adenohipofizare confirma gravitatea modificarilor structurale. Capilarele sanguine sunt puternic dilatate, sunt incarcate cu hematii, ceea ce sugereaza o posibila stagnare a circulatiei sanguine. Spatiile intercelulare sunt mult marite si in ele apar detritusuri ale unor celule lizate, peretii capilarelor sanguine sunt total distrusi, ceea ce determina o extravazare a continutului acestora printre celulele hipofizare.
La lotul FC1 apar doua situatii diferite, in functie de zona de hipofiza din care s-a prelevat materialul biologic. Astfel in zonele in care nu s-au produs alterari ale capilarelor sanguine, celulele STH prezinta fata de martor modificari mai putin relevante manifestate prin; modificarea conturului nuclear, vacuolizarea reticolului endoplasmic precum si a mitocondriilor. Numarul granulelor de secretie este aproape normal ceea ce arata ca acestea au fost sintetizate inainte de aparitia alterarilor structurale si ca urmare ele se gasesc stocate in celule. In zonele in care capilarele s-au spart se constata un inceput de generalizare a vacuolizarii intregii citoplasme si rarefierea granulelor de secretie.
Celulele ACTH prezinta nucleul cu contur neregulat si cu un inceput de condensare a cromatinei nucleare, in citoplasma apar dilatari ale elementelor complexului Golgi si ale reticolului endoplasmic si partial al unor mitocondrii, ceea ce conduce la o scadere a numarului granulelor de secretie.
Intr-o imagine de ansamblu la lotul FC2 se remarca numarul mare de celule STH fata de lotul martor prepuber. Celulele STH sunt dispuse in grupuri in apropierea capilarelor sangvine. Marea majoritate a celulelor prezinta nuclei sferici, dar la o parte din celule se remarca un contur usor neregulat al acestora. Granulele de secretie sunt numeroase si ocupa aproape in intregime volumul celular. Mitocondriile sunt dispuse intre granule, sunt umflate si au matricea mitocondriala rarefiata, sugerand un proces de alterare a activitatii acestora . Exista un numar relativ mic de celule care prezinta nucleul condensat cu tendinta de picnozare . De asemenea se poate observa ca la aceste celule spatiul perinuclear este dilatat. In citoplasma lor mitocondriile sunt complet veziculizate, iar numarul granulelor de secretie este mai mic comparativ cu celulele STH de la lotul prepuber.
Celulele ACTH prezinta o structura aproape normala, cu granule de secretie dispuse de-a lungul membranei celulare. Nucleul este ovalar dar are contur usor neregulat. Citoplasma este mediu electrondensa, contine mitocondrii alungite, profile de RER scurte si inguste. Complexul Golgi prezinta aspect normal.
La loturile tratate cu fluocinolon in asociatie cu propranolol ultrastructura adenohipofizei se modifica semnificativ. Scade numarul celulelor STH modificate atat la prepuberi cat si la puberi, ceea ce este in concordanta cu rezultatele histologice si gravimetrice. Celulele STH prezinta ultrastrucutura apropiata de celulele lotului martor. Ceea ce este in concordanta cu rezultatele gravimetrice conform carora are loc o usoara crestere in greutate corporala comparativ cu loturile tratate numai cu fluocinolon unde am inregistrat o scadere semnificativa a greutatii corporale si incetinirea ritmului de crestere mai ales la prepuberi. Asocierea tratamentului fluocinolonic cu propranolol determina blocarea receptorilor beta-adrenergici ceea ce permite functionarea celulelor somatotrope.
Studiul ultrastructural al corticosuprarenalei la lotul M1 arata ca celulele din zona fasciculata sunt de forma poligonala si sunt dispuse in cordoane. Celulele poseda in centrul lor cate un nucleu sferic sau neregulat, cu nucleol evident iar heterocromatina este dispusa atat in mici blocuri dispersate in cariolimfa cat si de-a lungul membranei nucleare interne. Caracteristic este faptul ca in celule se gasesc numeroase mitocondrii sferice avand criste tubulare. In unele mitocondrii se pot observa la interior si o serie de formatiuni dense, fasciculare. De asemenea celulele poseda relativ numeroase granule slab electrondense si un numar redus de lizozomi. Complexul Golgi este situat in apropiera nucleului si este bine dezvoltat, prezinta numeroase microvezicule, ceea ce demonstreaza existenta unui proces intens de sinteza hormonala. In matricea citoplasmica se gasesc relativ numerosi ribozomi dispusi de regula in polizomi. Printre mitocondrii se gaseste reticol endoplasmic neted dispus sub forma de profile scurte sau vezicule.
Studiul ultrastructural al zonei fasciculate la lotul FC1 a corticosuprarenalei arata ca numai anumite grupe de celule isi mai pastreaza structura celulara caracteristica acestei zone, insa si acestea sunt complet lipsite de granule de secretie. Cea mai mare parte a celulelor au structura profund alterata, fiind nefunctionale. La primul grup de celule se observa prezenta celulelor clare si intunecate, cele clare prezentand un numar redus de granule de secretie. Aceste celule au nucleii aproximativ sferici cu cromatina rarefiata, iar heterocromatina si nucleolul lipsesc. Matricea mitocondriala si cristele sunt rarefiate, iar in matricea citoplasmica se observa o reducere a reticolului endoplasmic precum si a ribozomilor. Celule intunecate, care de fapt sunt celule imbatranite, prezinta un nucleu dens cu tendinta de picnozare. La grupul al doilea de celule se remarca o rarefiere a cromatinei nucleare si o alterare pana la disparitie a nucleolului. Celulele acestui grup, atat cele clare cat si cele intunecate au mitocondriile aproape complet vacuolizate si adesea cu membranele rupte. O alta caracteristica a acestor celule este absenta compexului Golgi si a reticolului endoplasmic.
La lotul M2 se remarca o usoara scadere a secretiei hormonale, celulele fiind dispuse in cordoane paralele, nucleii sferici si nucleolii evidenti, cromatina este normal repartizata. Mitocondriile sunt numeroase dar la o parte din ele se remarca o usoara rarefiere a matricei si a cisternelor, ceea ce reprezinta o consecinta a procesului de imbatranire.
Zona fasciculata la FC2 prezinta modificari semnificative fata de lotul martor. Desi toate celulele prezinta alterari structurale in diferite grade, totusi este prezenta o mica cantitate de secretie hormonala, fata de celulele din lotul FC1 care sunt total lipsite de produsi de secretie. Relativ putine celule isi pastreaza organizarea in cordoane celulare paralele caracteristice zonei fasciculate. In aceste zone se pot observa celulele clare si intunecate. Celulele clare prezinta inca nuclei sferici, dar matricea citoplasmatica si cea mitocondriala este rarefiata. Aceste celule contin granule de secretie dar intr-o cantitate foarte redusa comparativ cu martorul. La celulele intunecate nucleul este hipercrom si prezinta tendinta de picnozare. Cea mai mare parte a celulelor nu mai sunt organizate in cordoane celulare; acestea prezinta nucleu picnotic, cromatina condensata, spatiul perinuclear puternic dilatat. Mitocondriile sunt aproape vacuolizate, dar cu toate aceste modificari mai au cateva granule de secretie in citoplasma. La o parte din celule se remarca liza matricei citoplasmatice si mitocondriale. O parte din capilarele sangvine sunt sparte, iar in aceste zone celulele apar dezorganizate.
La loturile tratate cu fluocinolon simultan cu propranolol, comparativ cu cele tratate numai cu fluocinolon, se constata ca aspectul ultrastructural este mozaicat (atat lotul prepuber FC1+ PR cat si la lotul FC2+PR), indicand o inbunatatire a sintezei hormonale. Apar celule cu un numar mai mic de granule de secretie comparativ cu martorii dar in numar mai mare comparativ cu loturile tratate numai cu fluocinolon. De asemenea scade numarul celulelor cu mitocondrii alterate. In unele celule se observa a usoara proliferare a reticolului endoplasmic neted. Aceasta observatie este in concordanta cu rezultatele histologice si gravimetrice, conform carora la loturile FC1+PR si FC2+PR suprarenala prezinta un aspect apropiat de cel inregistrat la loturile martor. In zona fasciculata sunt prezente spongiocitele, ceea ce arata ca sub actiunea agentului β-blocant se reduc efectele negative ale excesului glucocorticoidic si la nivelul corticosuprarenalei.
Rezultatele noastre coroborate cu cele din literatura de specialitate arata ca dermocorticoidul Fluocinolon-acetonid N absorbit transcutan, produce la sobolani un exces glucocorticoidic caracteristic starii de diabet steroidic, manifestat prin cresterea glicemiei, a lipemiei si respectiv a colesterolemiei. Aceste modificari metabolice au la baza modificari endocrine accentuate datorate alterarii functionarii axului hipotalamo-hipofizo-corticosuprarenalian. In conditii normale excesul glucocorticoidic determina printr-un mecanism de reglare feedback negativ inhibarea biosintezei CRH, a ACTH si implicit a corticosteroizilor.
Rezultatele ultrastructurale de la nivelul adenohipofizei arata clar alterarea structurii si functionarii celulelor STH. Rezultatele gravimetrice releva ca excesul glucocorticoidic determina incetinirea ritmului de crestere si dezvoltare al organismului animal ceea ce poate fi corelat cu modificarile ultrastructurale ale celulelor STH. De altfel unii cercetatori arata ca tratamentul cu Fluocinolon-acetonid N la sobolanul alb determina o incetinire a procesului de crestere si dezvoltare a organismului, sugerand ca acest efect ar fi rezultatul alterarii axului hipotalamo-hipofizar, fapt confirmat si de rezultatele cercetarilor noastre.
Analizand in ansamblu ultrastructura adenohipofizei, constatam ca tratamentul epicutan cu Fluocinolon-acetonid N determina modificari profunde la nivelul celulelor STH si mai putin evidente la nivelul celulelor ACTH, ultrastructura acestora fiind aproape normala. Ultrastructural nu s-au inregistrat modificari semnificative la nivelul celulelor ACTH, insa nefunctionalitatea celulelor din zona fasciculata a corticosuprarenalei sugereaza ca, desi sinteza ACTH nu pare a fi modificata, excesul glucocorticoidic in conditiile tratamentului nostru inhiba eliberarea granulelor de secretie din celulele ACTH. In lipsa ACTH colesterolul nu este captat de catre celulele corticosuprarenaliene, ca urmare nu are loc sinteza de corticosteroizi. Pentru acesta pledeaza si nivelul ridicat al colesterolului seric. In absenta ACTH nu au loc nici procese proliferative, ceea ce favorizeaza atrofierea suprarenalei, fapt demonstrat si de rezultatele noastre gravimetrice. Datele din literatura arata ca excesul glucocorticoidic realizat prin administrarea de glucocortioizi sintetici, inhiba atat multiplicarea cat si diferentierea si migrarea celulelor din zona fasciculata. Conform rezultatelor noastre structurale, corticala suprarenalei este mai ingusta comparativ cu corticala lotului martor atat la sobolanii prepuberi cat si la puberi, fapt reflectat si de reducerea semnificativa a greutatii relative a suprarenalelor.
Scaderea dependenta de varsta a greutatii relative a suprarenalelor, asociata cu reducerea volumului zonei fasciculate a corticosuprarenalei sub efectul tratamentului tegumentar acut fluocinolonic, evidentiaza de asemenea prezenta unui exces glucocorticoidic de origine exogena, care direct sau indirect inhiba biosinteza corticosteronului, blocand simultan secretia hormonului hipofizar de crestere (STH) si a hormonului hipotalamic de eliberare a STH. In acest context este de mentionat ca insulina si STH actioneaza anabolizant asupra biosintezei de proteine, iar excesul glucocorticoidic prin efecte directe si indirecte antiinsulinice si antisomatotrope mobilizeaza proteinele celulare stimuland gluconeogeneza hepatica pe seama aminoacizilor glucoformatori. Aceste aspecte sunt in deplina concordanta cu observatiile noastre referitoare la intarzierea procesului de crestere al sobolanilor prepuberi si puberi, precum si cu structura profund alterata a celulelor STH, evidentiata prin studiile ultrastructurale pe care le-am efectuat.
Asocierea tratamentului dermocorticoidic cu propranolol reduce efectele secundare inregistrate la nivelul celulelor STH, celulele ACTH prezinta ultrastructura apropiata de cele de la loturile martor. Celulele sunt poligonale, granulele de secretie sunt prezente de-a lungul membranei celulare. Aceasta observatie este in concordanta cu rezultatele structurale si ultrastructurale de la nivelul corticosuprarenalei. Prezenta ACTH este necesara atat pentru proliferarea zonei fasciculate cat si pentru functionarea normala a celulelor din zona fasciculata. Prezenta secretiei hormonale si la nivelul celulelor din zona fasciculata arata ca blocarea receptorilor beta adrenergici cu propranolol reduce efectele secundare ale excesului glucocorticoidic in conditiile experimentului nostru.
Rezultate biochimice si gravimetrice
Rezultatele noastre, in consens cu cele din literatura, arata ca dermocorticoizii absorbiti transcutan, la sobolani, produc un exces glucocorticoidic caracteristic starii de diabet steroidic, manifestat prin cresterea glicemiei, a lipemiei, respectiv a colesterolemiei. Aceste modificari metabolice au la baza modificari endocrine profunde datorate alterarii functionarii axului HHC.
Din analiza statistica a datelor obtinute la sobolanii Wistar masculi prepuberi si puberi rezulta ca tratamentul topic cu dermocorticoidul Fluocinolon-acetonid N determina o hiperglicemie semnificativa atat la sobolanii prepuberi cat si la cei puberi. La sobolanii prepuberi (FC1) glicemia creste cu 31,94%, la puberi (FC2) cu 117,46 %. Blocarea receptorilor β-adrenergici cu Propranolol atenueaza semnificativ efectul hiperglicemiant steroid-diabetogen al tratamentului cu Fluocinolon-acetonid N, reducand considerabil nivelul glicemiei cu 14,74 % la prepuberi, respectiv cu 19,71% la puberi.Hiperglicemia indusa de tratamentul topic cu Fluocinolon-acetonid N la sobolanii albi este rezultanta hiperproductiei hepatice de glucoza, a intensificarii gluconeogenezei si glicogenezei hepatice, a rezistentei musculare fata de actiunea insulinei.Cresterea glicemiei reflecta o insulinorezistenta tisulara puternica, indusa de excesul glucocorticoidic de natura exogena, efect ce este atenuat de tratamentul cu Propranolol (Fig. 1).
Fig . 1. Histograma modificarii procentuale a glicemiei la loturile tratate fata de martori.
Analizand fig.2 se observa ca tratamentul dermocorticoidic determina o hipercolesterolemie semnificativa. La prepuberi (FC1), creste nivelul colesterolului seric cu 26,47 %, iar la puberi (FC2) cu aproximativ 28%. Administrarea Propranololului reduce considerabil concentratia colesterolului sanguin, cu 18,02 % si cu 17, 2 %, fata de loturile tratate cu Fluocinolon-acetonid N.
Fig. 2. Histograma variatiei procentuale a concentratiei serice de: colesterol (C), acizi grasi liberi (AGL), lipide totale serice (L), trigliceridelor serice (TRG) la loturile tratate fata de loturile martor.
Cresterea colesterolului seric este asociata cu cresterea concentratiei acizilor grasi liberi (AGL), a trigliceridelor, precum si a lipidelor totale serice (Fig.2). La prepuberi, AGL creste cu 122,56%, trigliceridele cu 473,91%, lipidele totale cu 102,66%. La puberi, AGL creste cu 111,87%, trigliceridele cu 276,78%, iar lipidele totale cu 57,86% fata de martori. Sub efectul blocarii receptorilor β-adrenergici cu Propranolol se reduce semnificativ concentratia AGL, cu 34,71% la prepuberi si cu 36,48% la puberi fata de valorile obtinute la loturile tratate cu Fluocinolon-acetonid N.
Simultan cu reducerea nivelului crescut al AGL se micsoreaza semnificativ concentratia sanguina a trigliceridelor si a lipidelor totale. Sub actiunea tratamentului cu Propranolol, concentratia trigliceridelor scade cu 54,04% si cu 49,09%, iar a lipidelor totale cu 36,40% si, respectiv, cu 27,93% fata de valorile obtinute la loturile supuse tratamentului cu Fluocinolon-acetonid N. Nivelul crescut al AGL seric este un factor important de potentare a insulinorezistentei periferice si, in special, a muschiului striat, la nivelul caruia consumul preferential de AGL fata de glucoza intensifica gradul hiperglicemiei, caracteristic diabetului noninsulinodependent.
Analizand rezultatele sinoptice reiese ca sub actiunea tratamentului fluocinolonic se intensifica degradarea proteinelor, observatie sugerata de cresterea activitatii transaminazelor serice, precum si a fosfatazelor. La prepuberi ASAT si ALAT cresc cu 12,32% si, respectiv, cu 9,85 %. La puberi, activitatea acestor enzime este mai puternica (Fig.3), ceea ce explica si modificarile structurale intense de la acest lot. In timp ce la prepuberi doar la ASAT am inregistrat o modificare semnificativa, la puberi am inregistrat o crestere semnificativa atat a activitatii ASAT cat si a activitatii ALAT. ASAT creste cu 24,41 %, ALAT cu 94,10 %. De asemenea, intensa activitate a acestor enzime explica si procesele de atrofiere observate la suprarenale, timus si splina .
Sub actiunea tratamentului cu Propranolol se reduce hiperactivitatea transaminazelor ASAT si ALAT, ASAT cu 26, 64% la prepuberi si cu 8,72% la puberi, ALAT cu 28,80 % la prepuberi si, respectiv, cu 39,31% la puberi.
Fig. 3. Histograma activitatii enzimelor ASAT, ALAT, fosfataza acida (Pac), fosfataza alcalina(Pal) la loturile tratate fata de martori.
Paralel cu aceste modificari am inregistrat la loturile tratate cu Fluocinolon-acetonid N intensificarea activitatii fosfatazelor. Fosfataza acida creste la prepuberi cu 94,78%, la puberi cu 66,53 %. Fosfataza alcalina creste la prepuberi cu 44,26 %, la puberi cu 111, 72%. Intensificarea activitatii fosfatazelor explica si fenomenele de degenerescenta observate la celulele STH si GTH, precum si la celulele din zona fasciculata. Atat in hipofiza cat si in corticosuprarenala apar zone intense de liza si vacuolizare a organitelor cu rol in elaborarea si eliberarea granulelor de secretie.
Sub efectul blocarii receptorilor β-adrenergici cu Propranolol, hiperactivitatea fosfatazei acide serice indusa de Fluocinolon-acetonid N se reduce cu 44,86% la prepuberi si cu 42,6% la puberi, iar a fosfatazei alcaline serice se micsoreaza cu 17,80% la prepuberi si, respectiv, cu 55,32% la puberi, fata de valorile obtinute la loturile tratate cu Fluocinolon-acetonid N (Fig. 3).
Dinamica greutatii relative a suprarenalelor, timusului si splinei demonstreaza ca excesul glucocorticoidic realizat prin absorbtia transcutana a Fluocinolon-acetonid N, la loturile de animale prepubere si pubere determina scaderea semnificativa a greutatii relative a organelor luate in studiu. La prepuberi greutatea relativa a timusului scade cu 64,4 % iar la puberi cu 47,31 % fata de martori.
Din aceste rezultate reiese ca scaderea marcanta a greutatii relative a timusului la sobolanii prepuberi si puberi, demonstreaza potenta timolitica ridicata a acestui dermocorticoid, indicand in acelasi timp scaderea capacitatii imunologice a organismului tanar, timusul fiind organizatorul multor reactii imune specifice si nespecifice. Rezultatele noastre precum si cele din literatura arata ca timusul este un organ tinta al excesului glucocorticoidic endogen si exogen. Atrofia timica in conditiile experimentului nostru poate fi considerat un indiciu al excesului glucocorticoidic.
Asocierea tratamentului fluocinolonic cu propranolol, reduce semnificativ efectul timolitic al unguentului, la prepuberi cu 51,88% si la puberi cu 27,21% (Fig. 4).
Atrofierea suprarenalei la prepuberi este in proportie de 29,11 %, la puberi de 33 % fata de martori. De asemenea am inregistrat o scadere semnificativa a greutatii splinei atat la prepuberi cat si la puberi, astfel in primul caz se observa o reducere de 38,83 % in al doilea caz de 34,84 %.
Fig. 4. Histograma variatiei procentuale a greutatii relative a timusului (GRT), suprarenalelor (GRSP) si splinei (GRS) in conditii normale si de tratament.
Scaderea dependenta de varsta a greutatii relative a suprarenalelor, este in conformitate cu rezultatele noastre structurale si ultrastructurale, care arata ca excesul glucocorticoidic determina reducerea volumului zonei fasciculate a corticosuprarenalei, ceea ce evidentiaza de asemenea, prezenta unui exces glucocorticoidic de origine exogena, care direct sau indirect inhiba biosinteza corticosteronului, blocand simultan secretia de STH si a hormonului hipotalamic de eliberare a somatotropului. In acest context este de mentionat ca insulina si STH actioneaza anabolizant asupra biosintezei de proteine, iar excesul glucocorticoidic prin efecte directe si indirecte antiinsulinice si antisomatotrope mobilizeaza proteinele celulare stimuland gluconeogeneza hepatica pe seama aminoacizilor glucoformatori. Aceste aspecte sunt in deplina concordanta cu observatiile noastre referitoare la intarzierea procesului de crestere al sobolanilor prepuberi si puberi, precum si cu ultrastructura profund alterata a celulelor STH, evidentiata prin studii ultrastructurale .
Efectul atrofiant al excesului glucocorticoid asupra suparenalei in conditiile experimentului nostru, este redus semnificativ de tratatmentul concomitent cu propranolol, cu 78, 72% la prepuberi si cu 26,60% la puberi. Splenoreductia indusa de Fluocinolon-acetonid N prin tratamentul cu propranolol se micsoreaza cu 57,46% la prepuberi si cu 24,50% la puberi (Fig. 4).
Ritmul de crestere in greutate corporala a indivizilor (Tabel 1) arata ca tratamentul cu Fluocinolon-acetonid N reduce substantial sporul greutatii corporale. In cazul animalelor martor de 30 de zile sporul greutatii corporale fata de valoarea initiala (prima zi de tratament) este de 11,27 %, sub efectul tratamentului fluocinolonic valoarea acestui parametru se reduce cu 3,53 % fata de valoarea initiala din prima zi de tratament.
Tabel 1 Dinamica greutatii corporale in conditii normale si de tratament
__________ ______ ____ ______________
Loturi Greutatea corporala (g) a indivizilor_______________
a 12 3 4____
M1 57,1 ± 1,2 60,3 ± 1,4 63,8 ±1,663,6 ±1,6
b 5,58% 11,71% 11,27%**
FC156,6 ± 1 57,1 ± 0,956,6 ± 1 54,6 ± 1,1
b 0,79%______0%__ -3,53%__
PR+FC1 59,7 ±0,9 60,6 ± 0,9 60,9 ± 0,8 58,2 ± 0,9
b 1,45%1,87% -2,51%___
M2 181,7 ± 3,8 187,5 ± 3,9 188,6 ± 3,5 183,3 ± 3,9
b 3,17% 3,82% 0,90%__
FC2 148,3 ±4,5 145,1 ± 4,1137,8 ± 4,1 126,7 ± 4,9
b -2,15% -7,09% -14,56%*
PR+FC2 190 ± 6,31 201,5 ± 6,5195,7 ± 5,8 189,5 ± 5,8
b -1,28%-1,62% -5,03%_
a- Perioada de tratament
b-Sporul greutatii corporale fata de prima zi de tratament
* Valori semnificative (P<0,01).
** Valori foarte semnificative (P<0,001).
Sub actiunea propranololului greutatea corporala se reduce cu 2,51%. La lotul martor de 60 de zile sporul greutatii corporale al indivizilor fata de valoarea initiala din prima zi de tratament este de 0,90 %, sub efectul tratamentului valoarea acestuia scade semnificativ cu 14,56 %, in timp ce sub efectul propranololului stagneaza, fiind cu 5,03 % sub nivelul inregistrat la inceputul tratamentului.
Rezultatele noastre gravimetrice sunt in concordanta cu rezultatele din literatura care demonstreaza ca excesul glucocorticoidic determinat fie de actiunea factorilor de stres, fie de tratamentele cu glucocorticoizi sintetici provoaca atrofierea timusului, suprarenalelor, si respectiv, a splinei.
Scaderea greutatii relative a suprarenelei si timusului se poate explica si prin faptul ca, glucocorticoizii avand actiune catabolica puternica asupra proteinelor, determina accelerarea degradarii lor in aminoacizi. Intensificarea a activitatii enzimelor ASAT si ALAT serice, dependenta de varsta indivizilor, paralel cu exacerbarea activitatii hepatice a acestor enzimesub influenta tratamentului fluocinolonic, demonstreaza ca excesul GC indus prin absorbtia transcutana a dermocorticoidului Fluocinolon-acetonid N, la nivelul ficatului, activeaza sinteza de novo a enzimelor participante la procesele de transaminare a aminoacizilor glucoformatori mobilizati din tesuturi si de transformare a acestora in rezerve glucidice disponibile pentru productia hepatica de glucoza prin stimularea activitatii G-6-P-azei hepatice.
Concluzii
1. Excesul glucocorticoidic indus experimental determina modificari morfofiziologice ale axului HHC care interfereaza cu activitatea receptorilor β-adrenergici.
2. Propranololul reduce semnificativ modificarile structurale, ultrastructurale si metabolice induse de Fluocinolon-acetonid N.
3. Excesul glucocorticoidic la nivelul hipotalamusului actioneaza mai mult pe cale nervoasa, determinand activarea zonelor adrenergice extraparaventriculare cu rol in stimularea secretiei de CRH.
4. La nivelul adenohipofizei, excesul glucocorticoidic blocheaza eliberarea secretiei hormonale.
5. La nivelul corticosuprarenalei, excesul glucocorticoidic inhiba atat secretia hormonala cat si activitatea proliferativa.
6. Pe fondul blocarii receptorilor β-adrenergici cu Propranolol la sobolanii masculi Wistar de 30 si 60 de zile, efectul hiperglicemiant si hiperlipidic al tratamentului epicutan cu Fluocinolon-acetonid N unguent se reduce substantial, dependent de varsta indivizilor.
7. Propranololul reduce hiperactivitatea transaminazelor, fosfatazelor alcalina si acida din serul sanguin, cauzata de absorbtia transcutana a unguentului Fluocinolon-acetonid N.
8. Atrofierea organelor luate in studiu precum si scaderea ritmului de crestere a organismului animal sub actiunea tratamentului cu Fluocinolon-acetonid N sugereaza efectul antisomatotrop al excesului glucocorticoidic.
9. Propranololul reduce semnificativ efectul antisomatotrop al excesului glucocorticoidic.
10. Propranololul atenueaza efectul timolitic, adreno- si splenoatrofiant al excesului glucocorticoidic provocat de tratamentul cu Fluocinolon-acetonid N
11. Activarea receptorilor β-adrenergici de catre adrenalina circulanta este un factor permisiv de potentare in actiunile sistemice adverse diabetogene si endocrino-metabolice de risc cauzate de tratamentul cu Fluocinolon-acetonid N.
12. In reducerea actiunii adverse sistemice a dermocorticoidului Fluocinolon-acetonid N de catre propranolol, varsta sobolanilor joaca un rol conditionant major.
13. Rezultatele noastre demonstreaza efectul antiglucocorticoid al propranololului.
