Populatiile limfocitare si markerii lor de suprafata

Populatiile limfocitare si markerii lor de suprafata

din totalul celulelor seriei albe, limfocitele reprezinta cam 25-40%, ceea ce corespunde unei valori absolute de 1500-4000 de limfocite pe mm³

din punct de vedere morfologic, se impart in:

1.     Limfocite mici

aproximativ 80-85% din totalul limfocitelor periferice

diametru 6-9 µm

raport nucleu/citoplasma supraunitar

subvarietati:

a.     limfocite T

b.     limfocite B

2.     Limfocite mari

10-15% din totalul limfocitelor periferice

diametru 10-16µm

prezinta ciplasma foarte abundenta ce inconjoara de jur imprejur nucleul

in citoplasma sunt prezente din abundenta granulatii azurofile usor de evidentiat in microscopia optica

se numesc LGL (Large Granular Limphocytes)

ea include celulele NK implicate in imunitatea naturala si RIC

1.     Limfocitele mici

diferenteierea LT/LB NU poate fi facuta niciodata pe baza unor criterii morfologice

diferente din punct de vedere electronomicroscopic

diferentierea se face rapid si eficient pe baza unui test functional: testul Rozetarii (foarte vechi, consta in punerea in contact a limfocitelor raportate anterior prin tehnici de gradient cu eritrocite de oaie; singurele care angajeaza legaturi cu acestea si formeaza conglomerate celulare sunt LT)

LB NU sunt celule rozetante

LT prezinta pe suprafta lor un receptor tipic de adeziune intercelulara (CD2). El NU exista pe suprafata LB

LT NU reprezinta o populatie celulara omogena, ci este foarte heterogena din punct de vedere functional

avem 4 subvarietati de LT:

a.     TH

b.     TC

c.      TS

d.     TCS (contrasupresoare)

diferentierea dintre ele NU poate fi facuta pe baza criteriilor morfologice si nici pe baza testului rozetarii pentru ca toate rozeteaza la fel

diferentierea dintre ele se face prin evidentierea markerilor de suprafata

pe TH se afla un marker diferit de TC, TS, TCS

markerii pot fi identificati cu ajutorul unei tehnici - flaucitometrie (citometrie in flux). Ea se bazeaza pe utilizarea Ac monoclonali (artificiali, cu inalta specificitate, marcati fluorescent si recunosc tipic NUMAI 1 marker)

conteaza de fapt merkerii de suprafata, NU forma limfocitelor

Limfocitele T

Caractere generale

reprezinta populatia limfocitara majoritara prezenta in sangele periferic (68-80% din totalul limfocitelor periferice)

sunt celule cu durata de viata lunga sau foarte lunga (ani, yeci de ani, cat o viata de om)

celule intens recirculante (ele "patruleaza" continuu in intreg organismul in cautarea Ag pentru care sunt programate genetic)

I.        Receptorii de suprafata ai LT

expun pe suprafata lor 3 categorii de receptori:

1.     Receptori de recunoastere Ag

a.     Complexul TCR-CD3

rol in recunoasterea Ag (epitopilor)

b. Coreceptori: CD4 sau CD8 (recunoasterea moleculelor prezentatoare ale epitopilor    CD4 → MHC II

CD8 → MHC I

Din a. si b. => recunosc simultan atat Ag prezentat cat si moleculele prezentatoare ale acestora = recunoasterea Ag asociativa (reprezinta si principala cale de activare metabolica a LT)

2.     Receptori cu rol accesor in activarea LT:

o      CD28

o      CD45

3.     Receptori de adeziune intercelulara

permite stabilirea de contacte LT - alte tipuri de celule

o      CD2

o      LFA1 (CD11A/CD18)

CD = titulatura de catalog a receptorilor prezenti la suprafata limfocitelor. CD urmat de un numar = un singur receptor prezent la suprafata LT. s-a recurs la aceasta titulatura, pentru a se inlocui titulaturile mai vechi, descriptive. Unele se mai pastreaza (LFA1 - antigen asociat functiei leucocitare; VLA - antigen cu aparitie foarte tarzie, el apare dupa ce LT au fost activate, deci apar foarte tarziu; ICAM - molecule de adeziune intercelulara)

CD = cluster of designation

= class du differention

= clasa de diferentiere

1. Receptori de recunoastere Ag

Caracteristicile recunoasterii Ag realizata de LT

i.       LT recunosc Ag NUMAI dupa structura lor primara (secventa de aa). Recunosc in mod tipic doar Ag hidrofili

ii.      LT recunosc NUMAI Ag prezentat pe suprafata APC in complex cu molec MHC (LT, spre deosebire de LB NU recunosc niciodata Ag solubile)

iii.    Recunoasterea realizata de LT e prin definitie o recunoastere asociativa

a.     Complexul TCR-CD3

pe suprafata LT aflate in repaus exista in jur de 60000 de asemenea complexe

TCR (receptorul celulei T pentru Ag)

heterodimer constituit din 2 lanturi transmembranare (α si β) orientate cu capetele N-terminale afara si cele C-terminale in interiorul LT

lanturile sunt elaborate dupa codul unor gene diferite: α - Cz 14, β - Cz 7

in segmentul extracelular α si β se asociaza intre ele prin punti disulfurice

membrana LT strabatuta de lanturi separa 3 segmente in cele 2 lanturi

a.     segmentul extracelular

lanturile NU sunt liniare, ci adopta o configuratie imunoglobin-like (sunt organizate in bucle sau domenii situate simetric)

pe cele 2 lanturi exista cate 2 domenii, fiind de principiu formate din 100-110 aa

domeniile N-terminale sunt constituite din secvente de aa variabile/hipervariabile. Ele se noteaza cu Vα si Vβ

Vα si Vβ se asociaza intre ele si constituie o cavitate de dimensiuni mici = situs combinativ pentru Ag (SCAg)

celelalte 2 domenii sunt constituite din secvente de aa constante ca structura pe majoritatea limfocitelor. Se noteaza cu Cα si Cβ

dintre cele 2 perechi de domenii, cele mai importante din punct de vedere functional sunt cele variabile. Ele formeaza SCAg si pentru aceasta ele sunt responsabile de recunoasterea Ag

desi Vα si Vβ sunt implicate in recunoasterea Ag, ele NU angajeaza niciodata contacte cu Ag prin intreaga lor secventa de aa, ci realizeaza contacte cu Ag care sunt punctiforme, realizate prin intermediul unor mici secvente de aa (8-15) rezultate in urma plicaturarii Vα si Vβ. Aceste segmente sunt situate in varful plicaturilor si protruzioneaza adanc in cavitate, realizand legaturi cu Ag prin potrivire de forma sau complementaritate => ele se numesc CDR (regiuni determinante ale complementaritatii)

domeniile variabile Vα, Vβ

circular prin plicaturare

plicaturile exista prin intermediul celor 3 punti disulfurice intradomeniu

secventele din varful plicaturilor sunt doar ele responsabile de contactul cu Ag (8-15 aa). Ele se numesc CDR

pe fiecare domeniu exista 3 CDR. Ele constituie paratopul

restul secventelor = zona scheletala (FR - framework regions)

recunoasterea Ag se face prin stabilirea de contacte diferentiate intre CDR si complexul MHC - epitop

LT recunosc doar Ag care sunt prezentate pe suprafata APC

APC expun prin moleculele MHC un epitop

CDR1 - CDR2 angajeaza legaturi NUMAI cu moleculele MHC, recunoscand din acestea doar domeniile polimorfe (MHC I - α₁,α_2, MHC II - α_1, β₁)

CDR3 sunt singurele care asigura legaturi cu epitopul prezentat

e recunoscut atat epitopul, cat si prezentatorul acestuia, deci se realizeaza o recunoastere Ag asociativa intrareceptoriala (1 receptor - 2 molecule recunoscute)

domeniile constante Cα, Cβ

portiunea din segmentul extracelular al TCR intre domeniile intern si membranar = zona balama

in aceasta portiune (ZB) lanturile α si β se asociaza intre ele prin punti disulfurice => heterodimerul

ea e portiunea din TCR dotata cu maximum de flexibilitate. In jurul ZB TCR executa in mod continuu miscari de baleiere, care favorizeaza recunoasterea Ag (contactul cu complexul MHC - epitop prezentat pe suprafata APC)

b.     segmentul transmembranar

constituit din 22-25 aa

c.      segmentul intracitoplasmatic

este extrem de scurt - 5-12 aa

Functiile TCR

realizeaza recunoasterea Ag

genereaza semnale activatoare care apar secundar recunoasterii Ag

NU poate realiza transmisia sau transductia semnalelor catre sistemele enzimatice din profunzime. Ea se realizeza prin a doua componenta a complexului TCR-CD3, adica prin CD3

CD3

complex pentameric, format din 5 lanturi:

3 lanturi scurte si groase care prezinta segmente intracitoplasmatice destul de reduse (notate γ, δ, ε). Au GM de aproximativ 21-25kda si sunt elaborate dupa gene prezente pe cromozomul 11

la cele 3 lanturi scurte si groase se asociaza 2 lanturi foarte lungi si efilate care cel mai frecvent sunt identice intre ele (notate ℓℓ, au GM de 16kda, fiind elaborate dupa codul unor gene aflate pe cromozomul 1)

cele 5 lanturi se asociaza intre ele prin punti disulfurice si se asociazi la TCR

complexul heptameric TCR-CD3

CD3 trimite semnalele activatoare catre lanturile ℓ, ele avand acces la sistemele enzimatice de profunzime

CD3 fixeaza localizarea membranara a unor enzime foarte importante pentru activarea metabolica a LT. Ea se face la nivelul unor secvente mici de aa prezente in portiunea intracitoplasmatica a tuturor lanturilor CD3 - se numesc ITAM (motive activator imunoregulatorii tirozinice)

b. Coreceptori

CD4

coreceptor de recunoastere Ag

GM - 60kda

elaborat dupa codul unor gene prezente pe Cz 12

distributia: CD4 e distribuit tipic pe suprafata TH

el e considerat marker definitoriu pentru TH

TH = LT - CD4+

e o glicoproteina transmembranara orientata cu capatul N-terminal afara, C-terminal inauntru

exista 3 segmente:

a.     segmentul extracelular

organizat in bucle sau domenii

4 bucle diferite intre ele (D₁ D₂ D₃ D₄)

E implicat in recunoasterea moleculelor prezentatoare de Ag

Contactele se stabilesc cand LT coopereaza in vederea recunoasterii Ag cu APC, care expun MHC cu epitop

Receptorul recunoaste NUMAI moleculele MHC II, contactandu-l prin D₁, NUMAI domeniul monomorf al moleculei MHC II - α₂

b.     segmentul transmembranar

c.      segmentul intracitoplasmatic

este foarte lung

prin el contribuie esential la activarea TH

CD4 se afla in contact fizic cu o enzima (proteintirozinkinaza - PTK1). Varietatea tipica pentru TH e PTK p56^lck

p56 - proteina 56kda

lck - titulatura protooncogenei responsabila de sinteza acestei proteinkinaze (kinaza caracteristica leucocitelor)

CD8

glicoproteina transmembranara heterodimerica: 1 lant α si unul β

orientata cu capetele N-terminale afara si cele C-terminale la interior

elaborata dupa codul unor gene de pe Cz 2

particularitate: in segmentul extracelular prezinta cate un domeniu

domeniile sunt pozitionate simetric => conformatie Ig-like

segmentele intracitoplasmatice sunt foarte lungi

CD8 e prezent pe suprafata TC si TS (LT CD8+)

functii realizate diferit prin segmetul extracelular si cel intracitoplasmatic

segmentul extracelular: cooperarea intre TC/TS si APC (cooperarea se face cu ocazie prezentarii si recunoasterii Ag. In timpul cooperarii CD8 recunoaste specific NUMAI moleculele MHC I, angajand legaturi NUMAI cu domeniul monomorf al MHC I - α₃). Are rol important in activarea TC/TS

segmentul intracitoplasmatic: se afla in contact cu aceeasi PTK p56^lck

Cei 4 receptori (TCR, CD3, CD4, CD8) realizeaza recunoasterea Ag asociativa.

recunoasterea e dublu asociativa:

o      recunoastere Ag asociativa intrareceptoriala (realizata de TCR)

o      recunoastere Ag asociativa interreceptoriala (recunosc moleculele prezentatoare)

stabilirea unui numar mare de contacte intre moleculele prezentatoare si cele prezentate

LT → leg.  cu MHC (5) prin TCR si CD4/CD8

cu Epi (2) prin TCR

DAR ele se realizeaza DOAR cand e recunoscut epitopul

moleculele MHC de regula sunt molecule prezentate NUMAI pe membranele celulare => LT recunosc NUMAI Ag membranare

Ag membranare pot fi de 3 tipuri:

1)     Ag prezentate

2)     Ag constitutive

3)     Ag atasate

LT NU recunosc niciodata Ag atasate (Ac) si Ag constitutive (Ac/NK)

LT recunosc DOAR Ag prezentate in complex cu MHC

recunoasterea Ag de LT este o recunoastere MHC restrictiva

2.   Receptori cu rol accesor in activarea LT

CD28

glicoproteina transmembranara homodimerica

GM 45kda

distributie: prezent NUMAI pe suprafata TH/TC si niciodata pe TS

segmentul extracelular: cate o bucla pe domeniu

segmentul intracitoplasmatic: lung sau foarte lung

functie: favorizeaza net cooperarea dintre TH/TC si APC

in timpul cooperarii se stabilesc legaturi intre CD28 si un contraligand (CD80) - prezent NUMAI pe suprafata APC profesionale => semnale activatoare care se trimit catre profunzime, ele contand enorm pentru maturarea functionala a TH/TC

TH produce diverse tipuri de IL

TC produce CK

CD45

glicoproteina transmembranara

GM 100-200kda

pe suprafata tuturor celulelor de origine hematogena (exceptie eritrocitele si trombocitele)

pe suprafata LT e extrem de bine reprezentat (ocupa 10% din suprafata lor membranara)

NU exista ca receptor izolat

El se ataseaza prin punti disulfurice la lantul ℓ al CD3 => CD45 e activat intotdeauna ca urmare a stimularii Ag

Functie enzimatica, e o fosfataza (PTP) care ampreuna cu PTK formeaza un cuplu functional extrem de important

3. Receptorii de adeziune intercelulara

foarte importanti printre altele in cooperarea prin contact intre LT si APC

= cooperare cognitiva

CD2

receptor panT (pe toate LT) si pe suprafata celulelor NK

glicoproteina transmembranara

are GM 50kda

segmentul extracelular prezinta 2 domenii

segmentul intracitoplasmatic este foarte lung

functii: segmentul extracelular - stabilirea de contacte cu un contraligand prezent pe APC (LFA3[CD58]) - contacte prin complementaritate

segmentul intracitoplasmatic - pregatirea activarii LT, se afla in contact fizic cu o enzima PLC (fosfolipaza C)

cand se stabilesc contacte CD2-LFA3, CD2 sufera modificari conformationale ce permit translocarea PLC de la nivelul citoplasmei la nivelul membranei

LT naive = limfocite care in existenta lor NU au intalnit niciodata Ag pentru care au fost programate genetic sa il recunoasca

cuplul de adeziune CD2-LFA3 = cuplul de adeziune de linia intai (primele legaturi dintre APC si LT se stabilesc prin acest cuplu). Afinitatea reciproca CD2-LFA3 e extrem de mare

LFA1

prezent pe LT, LB, NK

2 lanturi α (CD11a) si β (CD18)

segmentul extracelular - 2 domenii (imagine de Ig-like)

segmentul intracitoplasmatic - foarte lung

functie: segmentul extracelular - stabilirea de contacte cu un contraligant prezent pe suprafata APC (din categoria ICAM)

prezent pe suprafata LT, in mod particular pe suprafata LT cu memorie (au intalnit de nenumarate ori Ag pentru care sunt programate sa il recunoasca)

cuplul de adeziune LFA1-ICAM = cuplul de linie a doua (legaturile se stabilesc mai tarziu si sunt instabile o perioada de timp)

Rolul receptorilor

stabilirea de contacte APC-LT pe arii intinse ale membranelor

aceste cupluri de adeziune favorizeaza net prezentarea si recunoasterea Ag pentru ca MHC+Epi si TCR NU sunt pozitionate fata in fata. Astfel ele au timp sa pluteasca pe membrana ti sa vina in contact unul cu altul