Substratul biochimic al ereditatii

SUBSTRATUL BIOCHIMIC AL EREDITATII

1. Dovezile indirecte care indicau substratul biochimic al ereditatii

ADN - 1869, extras din leucocitele umane, functia necunoscuta

o      ulterior - izolat din diferite tipuri de nuclei = acid nucleic

1910 - 2 tipuri de acizi nucleici: acid deoxiribonucleic si acid ribonucleic

1924 - studii cu coloranti afinitate = cromosomii formati din ADN si proteine

toate celulele somatice - contin o cantitate constanta de ADN

o      cantitate variabila de ARN si proteine

proteinele - foarte diverse ca varietate de la un tip celular la altul

nucleii celulele din seria germinala (meiotice) = ½ din ADN-ul celulelor somatice

geneticienii au respins posibiul rol ereditar al ADN

• studii biochimice = lipsa diversitatii chimice, compozitie constanta a ADN
• nu a permis asocierea ADN cu diversitatea caracterelor unei specii
• diversitatea proteinelor asociata cu functia de material ereditar
• ADN considerat doar o retea de sustinere a structurii cromosomilor

2. Identificarea substratului biochimic al ereditatii

v    Experienta Griffith - 1928 a identificat colonii mutante de pneumococ

• aspect rugos (R-rough) in cultura pe mediu solid
• mutatia afecta o enzima implicata in sinteza polizaharidului capsular
• pierderea capsulei facea bacteriile vulnerabile la fagocitoza
• pneumococii virulenti = capsula - in cultura - colonii netede (S-smooth)
• frecventa mica mutatie si reversmutatie
• in coloniile R selectate apareau sporadic cateva colonii S
• in coloniile S selectate apareau cateva colonii R
• efectul mutatiei = modificarea observabila a fenotipului

• Griffith a vizat identificare cauzei tranzitiei reciproce intre coloniile S si R
• injectarea soarecilor cu pneumococi (R) vii = lipsa oricarui efect

o      injectarea soarecilor cu pneumococi (S) vii => pneumonie mortala

o      injectarea soarecilor cu pneumococi (S) morti = lipsa oricarui efect

o      injectarea soarecilor cu pneumococi (R) vii si pneumococi (S) morti

=> uneori pneumonie mortala

Concluzie:

o      exista ceva material in pneumococii S

o      care transmitea tulpinilor R fenotipul de virulenta (prezenta capsulei)

Griffith nu a putut explica acest fapt

o      a atribuit ciudatul efect unui ipotetic principiu de transformare

nici aceasta descoperire nu a reusit sa atraga atentia geneticienilor.

v    Experienta Avery, MacLeod si McCarty - 1944

• Beadle si Taum - 1941 - ipoteza ca moleculele codificate de gene sunt proteinele
• Avery, MacLeod si McCarty - 1944 - au repetat schema experimentului Griffith
• ? compozitia chimica a "principiului de transformare bacteriana" F.Griffith
• in loc de pneumococi S morti au utilizat un extract de celule bacterine lizate
• au constatat - rezultate foarte interesante si asemantoare cu cele a lui Griffith
• amestec de pneumococi R vii si extract total de la pneumococii S => pneumonie mortala
• ???? substanta care produce transformarea la bacterii,

• Avery si col. au eliminat succesiv cate unui component din extractul total:

o      extractul fara lipide = activ

o      extractul fara polizazaride =  activ

o      extractul fara o parte din proteine = activ

o      extractul fara acizi nucleici = inactiv

• s-a demonstrat ca acizii nucleici sunt principiul transformarii bacteriene, acest fapt trebuia probat in mod complementar, prin experimente derulate cu un nou protocol

o      culturi R + extract de ADN din tulpinile S + proteaze = colonii R si S

o      culturi R + extract de ADN din tulpinile S + ribonuclaze = colonii R si S

o      culturi R + extract de ADN din tulpinile S + deoziribonucleaze = colonii R

Concluzie: substratul biochimic al ereditatii este ADN

prin intermediul lui se transmitea fenotipul S la pneumococii R

Aceasta descoperire a constituit a-II-a mare piatra de hotar, dupa ipoteza lui Beadle si Tatum, care marca inceputul geneticii moderne.

v    Nici aceste rezultate nu au fost acceptate usor

v    Experienta A.Hershey si Martha Chase - 1952

• verificarea substratului ereditatii si la entitati mai simple decat bacteriile - la virusi
• "cobai" - bacteriofagul T-2
• infecteaza bacteria E. coli, se multiplica si apoi produce liza culturilor
• in compozitia lui proteinele si ADN-ul se gasesc in proportii egale

• ADN contine fosfor si nu exista sulf,
• proteinelor contin prin unii aminoacizi atomi de sulf, dar nu contin fosfor

• Hershey si Chase au marcat ADN-ul viral cu ³²P, iar proteinele virale cu ³⁵S
• cu virusii marcati cu ³²P sau ³⁵S, au infectat culturi diferite de E.coli
• ? - care din cele 2 substante marcate radioactiv vor intra in bacterii
• centrifugare I - indepartarea excesului de virusi de pe suprafata bacteriilor
• centrifugare II - separarea celulelor (sedimentul) de mediu (supernatant)
• bacterii infectate - ³⁵S prezenta in cea mai mare masura in supernatant
• bacterii infectate -³²P prezenta in cea mai mare parte in sediment

Concluzii:

v    numai ADN fagic patrunde in bacterii pentru a le infecta

v    proteinele raman in afara celulelor

v    dupa multiplicarea fagilor

50% din ³²P fixata de generatia anterioara era prezenta la descendenti

³⁵S transmisa la descendenti era sub 1% din cea fixata de ascendenti

v    ulterior - suportul ereditatii la metazoare si metafite este tot molecula de ADN

v    ADN este suportul universal al ereditatii in lumea vie, exceptie virusii cu ARN

3. Compozitia chimica a ADN

ADN = macropolimer: acid fosforic + glucid + baza azotata

Figura 3-1. Structura chimica a ribozei si d-ribozei.

Figura 3-2. Structura chimica a pirimidinei si a bazelor pirimidinice.

Figura 3-3. Structura chimica a purinei si a bazelor purinice.

Nucleozide = dezoxinucleozide (d-nucleozide):

adenina + d-riboza  = dezoxiadenozina (d-adenozina)

guanina + d-riboza  = dezoxiguanozina (d-guanozina)

timina + d-riboza  = dezoxitimidina (d-timidina)

citozina + d-riboza  = dezoxicitidina (d-citidina)

Figura 3-4. Structura chimica a nucleozidelor.

nucleozid + acid fosforic (P) = nucleozid 5'-monofosfat sau nucleotid:

2'-deoxiadenozina + acid fosforic = 2'-deoxiadenozin 5'-monofosfat (dAMP) sau acid 2'-deoxiadenozin 5'-monofosforic;             

2'-deoxiguanozina + acid fosforic = 2'-deoxiguanozin 5'-monofosfat (dGMP) sau acid 2'-deoxiguanozin 5'-monofosforic;             

2'-deoxitimidina + acid fosforic = 2'-deoxitimidin 5'-monofosfat (dTMP) sau acid 2'-deoxitimidin 5'-monofosforic;             

2'-deoxicitidina + acid fosforic = 2'-deoxicitidin 5'-monofosfat (dCMP) sau acid 2'-deoxicitidin 5'-monofosforic.

Figura 3-5. Structura chimica a d-AMP, d-ADP si dATP.

curent - simbolurile: dAMP, dGTP, dTMP si dCTP

nucleotidele constitue monomerii (caramizile) din care este construit ADN-ul

Monomerii se leaga prin legaturi fosfodiesterice intre radicalii 5'-P si 3'-OH

la capatul unei macromolecule de ADN se gaseste

o      in pozitia 5' un radical P

o      in pozitia 3'un radical -OH

v    orientarea moleculei este in sensul 5'-3'

Figura 3-6. Legaturile fosfodiesterice din catena ribozofosforica.

Nr. molecule de d-riboza sau de acidul fosforic = nr. Monomeri

compozitia in d-riboza si in radicali P constituie partea invariabila a structurii ADN

E.Chargraff - 1950 -compozitia in baze azotate si raportul dintre ele:

o      concentratia purinelor = concentratia pirimidinelor

[A] + [G] = [C] + [T]

o      concentratia unei purine - A = concentratia unei pirimidine - T

numarul lor este egal, adica raportul lor este unitar [A] / [T] = 1

o      concentratia celeilalte purine - G = concentratia celeilalte pirimidine - C

numarul lor este egal, respectiv ca si raportul lor este unitar [G] / [C] = 1

o      compozitie baze - neunitara (proportia dintre bazele purinice sau pirimidinice)

raportul ([G] + [C] ) / ([G] + [C])  + ([A] + [T]) ≠ 1 = % G+C

Tabelul 3-1. Compozitia in baze la diferite specii [%].

regulile lui Chargraff

o      constante pentru toate celulele unui organism = constanta de specie

o      domeniul de variatie la diferitele specii - cuprins intre 26-74%