|
|
|
VARIABILITATEA LA BACTERII
Bacteriile sunt supuse acelorasi legi ale ereditatii, unitare lumii vii, cu unele particularitati dictate de organizarea materialului genetic. Astfel, in timpul diviziunilor succesive (in lipsa unui accident genetic) toti descendentii unei bacterii sunt identici intre ei si identici cu celula din care provin. Aceasta este descendenta verticala cu formare de "clone" de indivizi identici, stabilitatea fiind posibila datorita cromozomului haploid cu set unic de gene.
Variabitatea la bacterii, latura a geneticii care are implicatii deosebite in medicina practica, poate fi explicata prin doua procese fundamentale:
. variatia fenotipica, care reprezinta schimbarea unor insusiri ale bacteriilor, ca adaptare la conditiile mediului inconjurator, fara sa intervina vreo modificare in genomul bacterian si
. variatia genotipica, ce rezulta prin modificarea genomului.
Aparitia modificarilor genetice la bacterii este cunoscuta de mult dar nu s-a stiut, insa, daca aceste modificari urmeaza aceleasi legi ca si la organismele cu organizare superioara. In 1943 s-a dovedit faptul ca modificarile proprietatilor unei populatii bacteriene este rezultatul unor variatii rare la un numar mic de celule, care se selecteaza si dau nastere unei populatii noi. Variabilitatea la bacterii se produce prin: mutatii, transfer de material genetic si transpozitie.
1. Mutatia
Modificarile spontane ale genomului se numesc mutatii si constau din modificarea secventei de nucleotide dintr-o gena. Ele pot fi punctiforme, inversii, insertii, deletii si mutatii secundare.
Mutatiile punctiforme afecteaza un singur nucleotid in cadrul unei gene si sunt reversibile. Consecintele unei astfel de mutatii pot fi:
. inlocuirea unui codon cu altul, ceea ce se va traduce prin inlocuirea unui aminoacid cu altul din structura unui polipeptid. Aceasta mutatie se numeste "mutatie cu sens gresit",
. aparitia unui codon nonsens. Mutatia nonsens impiedica sinteza in continuare a unui polipeptid, iar daca ea se produce la inceputul genei ce codifica un polpeptid - mutatie polara, acesta nu se va mai putea sintetiza deloc.
Insertia si deletia inseamna adaugarea, respectiv pierderea a doua pana la sute sau chiar mii de nucleotide, procesul fiind ireversibil. Acest tip de mutatie duce la modificarea importanta a secventei de aminoacizi, fiind denumita "mutatie cu schimbare de proiect".
Mutatiile secundare sunt mutatiile reverse, care restabilesc o secventa nucleotidica ce s-a modificat, iar mutatiile supresoare permit exprimarea functiei anterioare a unei gene care a suferit o mutatie, fara restaurarea codonilor initiali. Acest fenomen se explica prin sinteza unui ARNt care "stie" sa citeasca un codon nonsens.
Frecventa pe unitatea de timp cu care se produc mutatiile este diferita si se numeste rata de mutatie. Mutatia spontana variaza de la gena la gena intre 10 -6 si 10 -10.
Mutatiile duc la aparitia unor indivizi cu caractere noi, cum sunt rezistenta la chimioterapice, structura antigenica modificata, pierderea unor receptori specifici pentru bacteriofagi, pierderea capacitatii de sinteza a unui metabolit etc.
Din punct de vedere medical intereseaza in mod deosebit mutatia spre chemorezistenta care se poate produce dintr-o data, adica "one-step", sau in mai multe etape, "multistep".
Prin mutatie "one-step" bacteria devine rezistenta brusc "peste noapte" la un antibiotic, pe cand prin mecanism multistep se produc mutatii multiple, succesive, pana ia nastere o mutanta rezistenta la concentratii ridicate de antibiotic. Astfel prima mutanta va fi putin mai rezistenta decit tulpinile salbatice din care provine, mutanta a doua mai rezistenta decit mutanta 1 s.a.m.d.
Dat fiind ca mutatiile naturale sunt rare, este necesar un mijloc care sa selecteze mutanta pentru ca aceasta sa se transforme intr-o populatie bacteriana cu proprietati noi.
Rata mutatiei poate fi crescuta in mod considerabil prin agenti mutageni, ca, de pilda, raze X, UV, derivati acridinici, agenti alchilanti etc.
Mutatiile spontane sau induse pot duce la "pierderea" integrala a unui plasmid printr-o modificare ce produce deficiente ale mecanismului de replicare, astfel incit plasmidele nu vor mai fi "mostenite" de celulele fiice.
2.Transferul de material genetic
Organismele superioare se reproduc sexuat. Materialul genetic a 2 indivizi de sex opus se transmite combinat urmasilor. Bacteriile se inmultesc vegetativ prin diviziune directa, deci materialul genetic provine de la o singura celula. Cu toate acestea exista si la bacterii mecanisme care permit schimbul de material genetic de la o bacterie la alta. Dat fiind ca aceste mecanisme nu urmeaza legile sexuale ale transmiterii caracterelor ereditare, ele se numesc mecanisme parasexuale. Transmiterea materialului genetic de la celula donor la celula receptor este unidirectionala si se realizeaza prin transformare, transductie si conjugare.
2.1.Transformarea
Reprezinta transferul de material genetic de la o celula donor la una receptor sub forma de ADN pur, eliberat fie prin liza celulei donor, fie prin extractie chimica. Acest proces a fost observat pentru prima oara la pneumococi de Griffith in 1928. ADN-ul pneumococilor virulenti, capabili sa sintetizeze capsula, s-a transferat la mutante R, nevirulente, acestea din urma dobandind capacitatea de a sintetiza capsula. Transformarea s-a pus in evidenta ulterior la numeroase genuri cum sunt, de pilda, Streptococcus, Haemophilus, Bacillus, Neisseria, Salmonella etc. si se petrece nu numai intre tulpiile aceleiasi specii, ci si intre specii diferite.
Transformarea genetica este posibila numai daca bacteria receptoare se afla in stare de competenta, stare care-i permite inglobarea de ADN strain. Competenta este o stare fiziologica temporara a bacteriei, care variaza in functie de specie si de faza de multiplicare in care se afla bacteria. Dupa unii autori, celulele competente au pe suprafata lor un antigen special numit factor de competenta. In timpul starii de competenta se modifica structura peretelui celular, care devine mai poros, incarcat electropozitiv, favorizand legarea ADN-lui strain.
Transformarea depinde in egala masura si de unele proprietati ale ADN transformant, cum sunt structura dublu catenara si o dimensiune minima a moleculei de 1 x 106 daltoni.
Cu toate ca transformarea s-a descoperit experimental si se practica astazi pe scara foarte larga in tehnicile de inginerie genetica, ea se petrece in mod natural in mediile in care traiesc impreuna multe specii bacteriene si unde procesul de liza a celulelor bacteriene este frecvent, ca de exemplu in colon . Aici se pun in libertate cantitati mari de ADN care, daca intilneste celule bacteriene in stare de competenta, va patrunde si se va recombina cu genomul acestora, conferindu-le caractere noi.
Majoritatea bacteriilor nu sunt in mod natural capabile de transformare dar experimental s-au dezvoltat metode de inducere artificiala a starii de competenta foarte utile ingineriei genetice.
2.2.Transductia
Transductia reprezinta un transfer de gene cromozomiale de la o celula bacteriana la alta, mediat de bacteriofagi. Unii bacteriofagi sunt capabili sa transfere orice gena bacteriana (transductie generalizata) iar altii numai anumite gene (transductia specializata).
Transductia generalizata este mediata de fagii virulenti, litici, care dupa patrunderea in celula bacteriana se multiplica si determina liza celulei gazda. In timpul lizei celulei bacteriene cromozomul acesteia se fragmenteaza. Se poate intimpla, ocazional, ca un fragment cu o dimensiune apropiata de cea a genomului fagic sa se integreze in capisda bacteriofagului, in locul genomului fagic. Astfel de fagi sunt defectivi si nu se vor mai putea replica, dar pot patrunde in alte celule bacteriene injectindu-le ADN-ul, ce provine de fapt din genomul celulei donoare. ADN-ul se va integra in cromozomul celulei receptoare prin recombinare, conferindu-i acesteia caractere noi, ca, de exemplu, rezistenta la chimioterapice, proprietati ce tin de patogenitatea bacteriei etc.
Transductia specializata este mediata de fagii temperati. Dupa patrunderea in celula bacteriana a ADN-lui bacteriofagului temperat, acesta sufera initial un proces de circularizare dupa care se insera in cromozom prin recombinare sub forma de profag. Insertia in cromozom se face pe baza homologiei dintre 10 perechi de baza ale ADN fagic si bacterian. Profagul devine parte integranta a cromozomului bacterian, se va replica o data cu acesta si nu independent, deoarece este supus unui proces de represie din partea genomului gazda.
Bacteriile care au integrate in cromozomul lor un profag sunt in stare de lizogenie. In anumite conditii, insa, are loc un proces de derepresie si genomul bacteriofagic paraseste cromozomul bacterian devenind din nou autonom. Cand paraseste cromozomul bacterian poate detasa din acesta un fragment de ADN care va ramane legat de genomul bacteriofagic. Acest bacteriofag nu se va putea inmulti, fiind defectiv, dar va putea intra in alta celula integrandu-se in cromozomul acesteia tot sub forma de profag. Fragmentul provenit de la prima celula bacteriana poate sa codifice diferite caractere (rezistenta la antibiotice, secretia unor enzime, toxine etc.), ce se vor manifesta fenotipic la noua bacterie gazda.
Cel mai bine studiat exemplu de transductie specializata este cea mediata de fagul lambda si gena bacteriana ce codifica degradarea galactozei (lambda-gal).
Transductia specializata nu trebuie sa se confunde cu conversia lizogena. In acest caz caracterul nou al celulei bacteriene este codificat chiar de genomul bacteriofagului temperat. Fenomenul a fost descris pentru prima oara, asa cum am mai aratat, la Corynebacterium diphteriae, toxigeneza fiind tributara prezentei unui fag temperat in cromozomul bacterian.
2.Conjugarea
Conjugarea este transferul de material genetic de la o bacterie donoare la una receptoare printr-un proces de imperechere, ce se realizeaza prin contactul direct dintre cele doua celule. Prin conjugare se pot transmite plasmide, precum si gene cromozomiale (prin intermediul factorului F+).
Conjugarea la bacilii gram negativi.
Factorul F+ poate fi situat, asa cum s-a mai aratat, intr-un plasmid, favorizand transferul acestuia sau in cromozomul bacterian, facand posibil transferul unor gene cromozomiale de la o bacterie la alta. Celulele bacteriene care au factorul F+ integrat in cromozom se numesc Hfr (high freqency of recombination ), deoarece ele pot transfera material genetic cromozomial cu o frecventa mare, ceea ce duce la recombinarea unor gene din cromozomul bacteriei donoare cu material genetic al cromozomului celulei receptoare.
Prin intermediul factorului F+ inserat in cromozom se poate transfera o copie intreaga a cromozomului celulei donoare la cea receptoare.
Transferul integral dureaza in jur de 100 minute. Procesul de imperechere este un mijloc ideal de localizare a genelor pe cromozomul celulei donoare. Ca celula donoare se alege o tulpina Hfr. Aceasta va fi cultivata cu celule F-. Prin agitare puternica a mediului se intrerupe procesul de imperechere la anumite intervale de timp, si se cauta recombinanti printre celulele receptoare. Cu cit intreruperea recombinarii se produce mai repede cu atit gena studiata se afla mai aproape de varful moleculei de ADN transferata.
Transferul prin conjugare a plasmidelor este conditionata de prezenta in plasmid a genelor de transfer tra, care sunt responsabile de sinteza sex-pilului si de transferul plasmidului.
Conjugarea incepe prin sinteza sex-pilului care va adera de receptori specifici prezenti pe peretele celular al bacteriei receptoare. Dupa formarea legaturii dintre celula donor si cea receptor are loc replicarea de transfer a plasmidului. O catena parentala de ADN va ramane in celula donor, iar a doua va trece in celula receptoare, pe tiparul lor sintetizandu-se catene complementare.
Din punct de vedere medical importante sunt plasmidele conjugative de rezistenta - plasmidele R.
Dintre proprietatile plasmidelor de rezistenta ale bacililor-gram negativi, 3 sunt de interes medical deosebit :
. frecventa transferarii: frecventa transferului multor plasmide salbatice pe receptori adecvati este relativ scazuta 10-4/ cel., si se datoreaza faptului ca plasmidele tulpinilor salbatice sunt reprimate, adica produc un represor care inhiba activitatea propriei gene de transfer. Daca se incubeaza donorii si receptorii impreuna mai multe ore, numarul de celule recombinante cresc;
. spectrul de gazde: plasmidele transferabile R circula intre specii diferite. Acest transfer are loc si in laborator si in macroorganism. S-a descris astfel transferul de plasmide de la bacilul coli nepatogen la salmonele sau shigelle. Nu s-a observat insa transferul plasmidelor de la bacterii gram-negative la cele gram-pozitive;
. determinantii de rezistenta "R": caracteristici pentru plasmidele conjugative sunt determinantii de rezistenta multipli. S-au evidentiat astfel la tulpinile izolate din spital plasmide ce au factori de rezistenta fata de toate chimioterapicele uzuale (ampicilina, cefalosporine, streptomicina, tetraciclina, cloramfenicol, kanamycina, gentamicina, sulfonamide).
Conjugarea la bacterii gram-pozitive
S-au descris procese de imperechere si la bacteriile gram-pozitive ca, de pilda, la genurile Streptococcus, Streptomyces, Clostridium, procesul bazandu-se pe performanta celulei receptoare.
Celula receptoare produce un peptid cu mol. mica (GM=1000 daltoni) care determina sinteza unor substante proteice de agregare de catre celula donoare cu afinitate pentru unele substante adezive de pe suprafata receptorului. Se produce astfel o legatura strinsa intre receptor si donor cu formarea unei punti intercelulare care permite transferul de material genetic. Prin analogie cu substantele atragatoare la insecte peptidul ce induce substanta de agregare a fost desemnat ca sexpheromon.
2.4.Transpozitia
Transpozitia presupune integrarea intr-un genom al unui elemente genetic transpozabil din aceeasi molecula de ADN sau din alta prezenta in aceeasi celula. Elementele genetice transpozabile se impart, dupa structura si mecanism de translocare, in 3 clase:
CLASA I cuprinde seventele de insertie (IS) si transpozonii compusi.
Secventele de IS au in jur de 1000 de baze si fac parte in mod normal din cromozom sau plasmide. Ele sunt prezente in mai multe copii si sunt flancate la cele 2 capete a aceleasi baze, 10-40 pb-IR (inverted repeats), dar in ordine inversata. Acestea inrameaza secventa ce codifica proteine necesare procesului de transpozitie. IS nu confera ele insasi un caracter nou celulei, dar pot produce dupa insertia lor modificari in expresia genelor adiacente inserarii.
Transpozonii compusi constau din 2 IS care nu au nevoie de secventa de ADN pentru codificarea transpozitiei si delimiteaza determinanti de rezistenta sau a unor caractere ce pot apare in fenotipul bacteriei.Un exemplu de transpozon de clasa I este Tn 9 si Tn10, care codifica rezistenta la cloramfenicol si, respectiv, la tetraciclina.
Transpozitia elementelor din clasa I se face pe baza translocarii conservative, secventa transpozabila mutandu-se de pe repliconul donor pe cel receptor fara reduplicarea tranposozonului.
CLASA II - cuprinde familia de transpozoni TnA care se transloca dupa modelul transpozitiei replicative, adica prin reduplicarea Tn inainte de translocare. Tn original ramane pe loc, iar copia se insera in noul situs. La proces participa 2 enzime: transpozaza si rezolvaza. In timpul translocarii replicative se formeaza un produs intermediar intre repliconul donor si receptor care se numeste cointegrat si care va fi desfacut de rezolvaza. Pe langa genele care codifica enzimele necesare transpozitiei, Tn de clasa II mai contine o gena ce confera celulei un caracter. Tn3, de pilda, codifica rezistenta la Ampicilina.
CLASA III cuprinde bacteriofagii transpozabili ca, de pilda, fagul Mu si D 108, care folosesc transpozitia ca mod de replicare. Fagul Mu este un fag temperat care se insera in cromozomul celulei bacteriene dupa patrundere. Insertia acestui fag intrerupe activitatea genei in care s-a inserat si a unor gene neadiacente din acelasi operon. Fagul se replica, originalul ramane pe loc, iar copia se insera in orice alt loc de pe cromozom.
Insertia oricarei gene intre doua elemente transpozabile face posibila transferul ei prin recombinare neomologa, in aceeasi celula pe o molecula de ADN neinrudita structural.
Astfel, prin transpozitie se pot produce deletii, inversii, transpuneri de determinanti genetici de pe un plasmid pe altul sau chiar fuzionarea stabila a unor repliconi completi, de pilda a doua plasmide.
Evolutia rezistentei la antibiotice a bacteriilor nu poate fi conceputa astazi fara fenomenul de transpozitie.
Studii moleculare au relevat posibilitatea ca genele de rezistenta la antibiotice sa fi aparut cu mult timp inainte, la microorganismele producatoare de antibiotice. Acesti determinanti genetici au fost mobilizati si au patruns prin mecanismele transferului genetic la bacteriile importante din punct de vedere clinic.
Mecanismele transpozitiei sunt responsabile de formarea plasmidelor cu multirezistenta, prin inserarea succesiva pe un plasmid a determinantilor genetici de rezistenta situati intre doua elemente transpozabile de pe alte plasmide.
