INSULINA UMANA RECOMBINATA

INSULINA UMANA RECOMBINATA

Aspecte generale

Insulina este principalul hormon pancreatic si a fost descoperita in 1921, prin cercetarile efectuate in paralel de catre fiziologul roman N. Paulescu si de catre canadienii Banting, Mac Leod si Best, acestia din urma primind in 1923 premiul Nobel in fiziologie si medicina pentru izolarea insulinei si definirea rolului acesteia in tratamentul diabetului zaharat.

La putin timp dupa descoperirea insulinei au fost puse la punct procese de fabricatie care permiteau extragerea insulinei din pancreasul de porcine si bovine.

Din 1921 si pana in 1980, eforturile au fost indreptate in directia purificarii insulinei si elaborarii diferitelor formulari in vederea modificarii relatiei timp-actiune care sa permita un control imbunatatit asupra metabolismului glucozei.

Procesul de purificare a fost mult ameliorat prin optimizarea extractiei, a conditiilor de procesare si prin implementarea proceselor cromatografice (schimbatori de ioni, cromatografie in faza inversa) in vederea reducerii concentratiilor de impuritati generale proteice cat si a impuritatilor proteice asociate insulinei cum ar fi proinsulina si polimerii insulinei.

Elaborarea de formulari s-a concentrat asupra ameliorarii stabilitatii chimice prin deplasarea de la formulari cu caracter acid la formulari cu caracter neutru si prin modificarea profilului timp-actiune, lucru posibil prin folosirea diferitelor concentratii de zinc si protamina.

Astfel firma Eli Lilly a fost prima firma farmaceutica care a produs si comercializat, inca din deceniul trei, insulina animala care se extragea in cantitate de circa 100g din o tona de pancreas.

In 1952 s-a obtinut prima cristalizare a insulinei si s-a obtinut o insulina mai pura. In 1955 Sanger a stabilit structura chimica a insulinei: doua lanturi polipeptidice A si B formate respectiv din 21 si 30 de aminoacizi. In 1979 au fost sintetizate de Itakura genele corespunzatoare celor doua lanturi polipeptidice ale insulinei umane.

Intre 1978-1980 cercetatorii au obtinut insulina umana biosintetica si astfel s-au realizat cantitati suficiente pentru studii farmacodinamice si experimentari clinice in S.U.A., Anglia si Japonia. In anul 1982, organismele responsabile de controlul diferitelor medicamente din S.U.A., Anglia, Olanda si R.F.G. au aprobat comercializarea insulinei umane, produsa prin tehnologia ADN recombinat.

Firmele Eli Lilly din S.U.A. si Novo din Danemarca produc acum pe scara industriala insulina sintetizata de gene sintetice introduse in bacterii.

Testele clinice au dovedit ca aceasta insulina are aceeasi activitate ca si insulina inalt purificata din pancreasul bovin sau porcin, comercializat in prezent. In plus, ea nu produce efectele secundare pe care le provoaca uneori insulina de origine animala.

Importanta insulinei sintetizate prin inginerie genetica poate fi apreciata si din faptul ca firma Eli Lilly a investit in anul 1982 suma de 40 milioane de dolari pentru construirea a doua instalatii noi (una in S.U.A., iar alta in Anglia), necesare maririi capacitatii de productie. Actiunea merita a fi subliniata, mai ales ca firma amintita produce de peste 70 de ani (doi ani dupa descoperirea insulinei) acest hormon prin metodele conventionale.

Trebuie precizat ca productia de insulina umana prin inginerie genetica este rezultatul colaborarii dintre cercetatorii de la Genentech, Eli Lilly si City of Hope Medical Center din California.

Combinand metodologiile ameliorate ale purificarii cu tehnologia ADN recombinat, fabricantii de insulina pot la ora actuala sa ofere cea mai pura insulina care a existat vreodata (puritate mai de 98%).

Descrierea chimica a insulinei

Insulina matura, biologic activa, este o proteina mica cu greutate moleculara de aproximativ 5,7kD si cu 51 de aminoacizi.

Este constituita din doua catene polipeptidice distincte: catena A, continand 21 de aminoacizi si catena B formata din 30 de aminoacizi. Cele doua catene sunt legate intre ele prin doua legaturi disulfurice (A7 - B7 si respectiv A20 - B19). O a treia legatura disulfurica este o legatura intracatenara localizata in catena A intre resturile cisteinice A6 si A11.

Biosinteza si secretia insulinei din celulele beta pancreatice

Ca si alte proteine care se secreta, insulina este sintetizata sub forma unui precursor numit pre-proinsulina.

Trebuie precizat ca produsul de translatie al ARNm specific insulinei este pre-proinsulina, care contine atat proinsulina cat si o secventa de aminoacizi (presecventa sau secventa 'semnal') necesara transportului pre-proinsulinei prin membrana reticulilor endoplasmatici. Aceasta presecventa, denumita si semnalul peptidic, este indepartata enzimatic in timpul transportului pre-proinsulinei de la polizomi la veziculele celulelor pancreatice.    Biosinteza insulinei active (maturarea insulinei) are loc in veziculele celulelor pancreatice prin conversia enzimatica a proinsulinei in insulina. Procesele au loc in celulele beta pancreatice aflat in insulele Langerhans ale pancreasului care functioneaza independent, dar alaturi de o multitudine de alte tipuri de celule insulare. Prin conversia proinsulinei in insulina se produce de fapt eliminarea unei catene polipeptidice (polipeptida C) care in proinsulina face legatura intre catenele A si B.

Prin urmare, insulina matura este rezultatul final al conversiei: pre-proinsulina → proinsulina → insulina.

Reglarea secretiei de insulina

Factorii stimulatori ai secretiei insulinei sunt:

  glucoza serica chiar in cantitati fiziologice (80-100mg/dl);

-  alte monozaharide usor metabolizabile cum sunt fructoza, manoza;

-  aminoacizii in special arginina, lizina si leucina;

-  polipeptidul inhibitor gastric (GIP), cu functie de hormon local, polipeptid eliberat de mucoasa duodenala si jejunala la ingestia de glucoza.

 Factorii inhibitori ai secretiei insulinice sunt:

-  agonistii α-adrenergici; adrenalina prin α-receptori este un inhibitor fiziologic al insulinei;

-  somatostatina, produsa de celulele D(δ) din pancreas prin actiune paracrina.

Efectele biologice ale insulinei. Descrierea efectelor biologice ale insulinei

Efectele biologice la nivel celular ale insulinei sunt de o diversitate impresionanta:

-  stimularea captarii in celule a hexozelor;

-  stimularea captarii in celule a ionilor;

-  stimularea captarii celulare a aminoacizilor;

- modificarea activitatii unor enzime prin defosforilare

-  reglarea expresiei genelor pentru unele enzime reglatoare (glucokinaza, fosfoenopiruvat carboxikinaza);

-  redistribuirea unor proteine membranare ca:

- transportorii de glucoza;

- receptorii transferinei;

-  promovarea cresterii celulare, actionand ca factori de crestere.

 Procedee de obtinere a insulinei prin inginerie genetica

Tinand cont de complexitatea sintezei insulinei in pancreas, obtinerea insulinei umane cu ajutorul bacteriilor reprezinta intr-adevar o realizare deosebita. Trebuie precizat ca insulina produsa de bacteriile modificate este absolut identica cu insulina umana pancreatica.

Exista in momentul de fata doua procedee de obtinere a insulinei umane cu ajutorul bacteriilor modificate prin tehnologia clonarii genelor. Primul se bazeaza pe clonarea genelor corespunzatoare catenelor A si B ale insulinei, sintetizate chimic, iar al doilea pe clonarea ADNc corespunzator proinsulinei.

In ambele cazuri, clonarea se face in bacteria E. coli .

A. Obtinerea insulinei prin ADN recombinat construit din genele sintetizate chimic

Din structura insulinei mature s-a dedus structura genelor corespunzatoare in baza echivalentelor dictate de codul genetic.

In acest fel s-a stabilit ca pentru catena A a insulinei sunt necesare 63 de nucleotide inlantuite in mod specific, iar pentru catena B de 90 de nucleotide cuplate. Proiectul sintezei celor doua gene a mai prevazut atasarea la capetele lor a unor nucleotide care sa asigure, pe de o parte, cuplarea corecta a genelor de vector si, pe de alta parte, prezenta semnalelor necesare pentru pornirea si oprirea exacta a transcrierii genelor.

Pentru cuplarea corecta s-a prevazut adaugarea a 12 nucleotide, dintre care 6 asigura jumatate din situsul enzimei de restrictie EcoRI, iar celelalte 6 nucleotide jumatate din situsul enzimei de restrictie BamHI.

La randul ei, pornirea este realizata de codonul ATG plasat la inceputul genei intre situsul enzimei EcoRI si gena structurala; oprirea transcrierii este asigurata de doi codoni (TAA si TAG) plasati intre capatul genei structurale si situsul enzimei de restrictie BamHI.

Gena A a fost obtinuta din 12 oligodeoxinucleotide sintetizate chimic prin metoda fosfotriesterilor, iar gena B a fost obtinuta din 18 oligodeoxinucleotide diferite sintetizate prin aceeasi metoda chimica. Cele doua gene corespunzatoare catenelor A si B ale insulinei mature au fost apoi inserate independent pe cate un vector de clonare genetica prevazut cu elementele de control ale operonului lac.

Moleculele de ADN recombinat rezultate au fost utilizate pentru transformarea celulelor de E. coli.

In celulele transformate ADN recombinat se replica. Sub controlul elementelor de reglaj ale operonului lac se sintetizeaza complexul β-galactozidaza-catena A a insulinei in celulele transformate cu ADN recombinat continand gena A si complexul β-galactozidaza-catena B in celulele transformate cu ADN recombinat continand gena B a insulinei.

In final, cele doua catene ale insulinei sunt detasate de β-galactozidaza cu ajutorul unui reactiv chimic (BrCN) care actioneaza asupra metioninei situata exact la locul de jonctiune dintre cele doua componente.

Dupa purificare, cele doua catene se amesteca si, prin simpla oxidare cu aer, ele se cupleaza prin legaturi disulfurice, dand nastere insulinei, care este identica atat structural cat si functional cu insulina umana.

B. Obtinerea insulinei prin ADN recombinat continand gena pentru proinsulina

Acest procedeu are la baza construirea unor plasmide care sa contina secventele (genele) care codifica proinsulina sub forma ADNcomplementar. Acest ADNc se poate sintetiza in vitro din ARNm pentru proinsulina izolat din celulele beta din insulele Langerhans ale pancreasului. ARNm se izoleaza din aceste celule, se purifica prin cromatografie pe oligo-dT-celuloza si este apoi utilizat la sinteza de ADNc cu ajutorul reverstranscriptazei. La inceputul lantului de ADNc se ataseaza codonul ATG (sintetizat chimic) corespunzator metioninei. In acest fel are loc marcarea pentru ADNc si se asigura si delimitarea galactozidazei de proinsulina, ceea ce usureaza procesul de purificare a proinsulinei prin tratarea cu BrCN.

ADNc astfel pregatit este apoi cuplat cu vectorul plasmidial prevazut cu elementele de control ale operonului lac continand o mica parte din gena structurala a galactozidazei.

ADN recombinat rezultat este utilizat pentru transformarea bacteriilor E. coli. Celulele transformate produc o proteina compusa din β-galactozidaza si proinsulina. Aceasta, tratata  cu BrCN, elibereaza proinsulina, care apoi este convertita in insulina matura pe cale enzimatica.

Avantajele insulinei umane obtinuta prin ADN recombinat fata de insulina izolata din pancreasul animal sunt: nu induce afectiuni oculare (retinopatie) si renale (nefropatie), nu provoaca alergii (fata de 5% alergii la insulina animala), are un grad inalt de puritate, se poate obtine in orice cantitate, productia nu este dependenta de abatoare, care sunt aprovizionate discontinuu, iar testele clinice au stabilit ca insulina umana obtinuta prin inginerie genetica este mai activa decat insulina umana.

Formulari farmaceutice ale insulinei umane recombinate

Exista in literatura de specialitate ca si in practica medicala mai multe formulari care nuanteaza terapia cu insulina.

 Formulari ale insulinei sub forma de preparate solubile cu actiune rapida

Molecula de insulina are o sarcina negativa neta la pH neutru. Aceasta sarcina negativa neta a insulinei a fost folosita la dezvoltarea formularilor farmaceutice.

La inceput produsele cu insulina solubila au fost formulate in conditii solutii de pH acid care din punct de vedere chimic deveneau instabile. In aceste formulari vechi a fost identificat un proces de dezamidare considerabil la nivelul asparaginazei din pozitia 21 a lantul A si a fost observata pierderea activitatii biologice pe parcursul unei conservari prelungite in conditii de pH acid.

Eforturile facute pentru a ameliora stabilitatea chimica a acestor formulari solubile a dus la conceperea solutiilor neutre, stabilizate cu zinc prin folosirea capacitatii sale de a se autoasocia usor sub forma de dimeri sau sub forma de stari cu un ordin mai mare de autoasociere. De altfel din punct de vedere fiziologic, insulina este stocata in celulele beta ale pancreasului sub forma unor hexameri care contin zinc. Aceasta datorita posibilitatii de a se asocia sub forma de complecsi hexamerici distincti in prezenta diferitilor ioni metalici divalenti (0,33g atom/monomer).

Ca urmare in formularile simple (normale) neutre, insulina este stabilizata chimic prin adaugarea de zinc (~0,4%) si conservanti fenolici. Zincul duce la formarea unor structuri hexamerice distincte (care contin doi atomi de Zn/hexamer) si poate cupla 6 molecule de conservanti fenolici.

Preparatele cu insulina din comert contin si excipienti fenolici (fenol, m-cresol) ca agenti antimicrobieni. Aceste specii fenolice se cupleaza la locurile specifice de pe hexamerii Zn-insulinei, producand o modificare conformationala care mareste stabilitatea chimica a insulinei in preparatele comerciale (starea R6).

Formularile moderne ale insulinei pot contine, in afara zincului si a conservantilor fenolici, un agent pentru izotonicitate (glicerol sau NaCl) si un tampon fiziologic (fosfat de sodiu). Primul este folosit pentru a reduce lezarea tesutului si durerea la injectare. Ultimul este prezent pentru a impiedica deplasarea pH-ului in cazul unor formulari sensibile la pH.

Formularile normale (simple) neutre numite Insulina Regular prezinta o activitate maxima a insulinei dupa 2-3 ore, cu o durata maxima de 6-8 ore.

Ca si in cazul altor formulari, variatiile intervenite in relatia timp-actiune pot fi atribuite factorilor urmatori: doza, locul injectarii, temperatura si activitatea fizica a pacientului.

In pofida starii solubile a insulinei, in aceste formulari s-a observat o intarziere a declansarii actiunii. Aceasta intarziere a fost atribuita timpului necesar hexamerului pentru a disocia in dimeri si/sau monomeri inaintea absorbtiei prin membrane biologice. Aceasta disociere necesita difuziunea conservantului si a insulinei de la locul de injectare, diluarea efectiva a proteinei si deplasarea echilibrului de la hexameri la dimeri si monomeri.

Au fost elaborati analogi monomerici pentru evitarea proprietatii de autoasociere a insulinei si deci de reducere a intarzierii intervenite in relatia timp-actiune ai insulinei, in scopul obtinerii unui raspuns mai natural la cresterile post-prandiale ale concentratiei glucozei.

A fost elaborat un asemenea analog monomeric, prin schimbarea pozitiilor intre ele a lizinei (Lys 28) si prolinei (Pro 29) din lantul B al insulinei umane si astfel s-a realizat Insulina lispro care prezinta un profil mai rapid al relatiei actiune-timp, avand o activitate maxima dupa aproximativ o ora datorita posibilitatii reduse de autoasociere, comparativ cu insulina umana.

Cu toate acestea spre deosebire de unii analogi monomerici, Insulina lispro poate fi stabilizata in cadrul unui complex hexameric dependent de un conservant care asigura stabilitatea chimica si fizica necesara tuturor preparatelor de insulina pastrandu-si profilul sau rapid actiune-timp.

In afara formularilor rapide mentionate mai inainte, fabricantii au conceput formulari solubile care sa fie utilizate in pompe externe sau implantate. In majoritatea privintelor, aceste formulari sunt foarte asemanatoare cu insulina regular (simpla sau normala in cea ce priveste starea de asociere hexamerica, conservantul si zincul); cu toate acestea in formularile respective pot fi inclusi: agenti de tamponare si/sau surfactanti pentru a reduce agregarea fizica a insulinei care poate determina astuparea tubului pompei.

Formulari farmaceutice ale insulina cu actiune intermediara

Exista doua tipuri de preparate de insulina cu actiune intermediara: Insulina NPH si Insulina lente.

Initialele NPH se refera la 'Neutral Protamine Hagedorn', nume care vine de la inventatorul acestui preparat de insulina H.C. Hagedorn si este o suspensie cristalina neutra care este preparata prin co-cristalizarea insulinei cu protamina.

Ambele formulari permit obtinerea unor profile prelungite privind relatia timp-actiune prin faptul ca necesita dizolvarea unei forme precipitate si/sau cristaline a insulinei, etapa care limiteaza viteza de biodisponibilitate a insulinelor cu actiune intermediara si lunga. Insulina NPH are concentratii foarte mici de insulina solubila si protamina.

Protamina reprezinta un grup de proteine cu caracter bazic puternic, grup de substante strans inrudite care sunt obtinute din sperma de peste. In general, protamina este caracterizata printr-un numar de aproximativ 30 aminoacizi, dintre care arginina este in proportie de 65-70%.

Momentul in care, dupa cristalizare, in solutie nu mai exista protamina sau insulina masurabila este denumit ca fiind punctul de "isophane". De aceea Insulina NPH se mai numeste Insulina 'Isophane'.

Insulina NPH are o declansare a actiunii cuprinsa intre 1-2 ore, o activitate maxima cuprinsa intre 6-12 ore si o durata a activitatii de 18-24 ore.

Ca si in cazul altor formulari, variatiile observate la relatia timp-actiune sunt datorate unor factori cum ar fi: doza, locul injectarii, temperatura si activitatea fizica a pacientului.

Insulina NPH poate fi amestecata usor cu Insulina regular fie extempore, de catre pacient, fie in forma in care se obtine de la fabricant, respectiv sub forma unei formulari preamestecate.

Insulina preamestecata, de exemplu NPH/Regular in raportul 70/30 sau 50/50, ofera pacientului o ameliorare a exactitatii la dozare si, in consecinta, o ameliorare a controlului glicemiei.

Au fost solutionate si controversele privind imunogenitatea la protamina prin folosirea de Insulina Lente sau Insulina Ultralente.

Insulina Lente este o suspensie de zinc-insulina care a fost conceputa pentru o singura injectie zilnica. Ea este un amestec constituit din doua forme insolubile de insulina, 70% cristale romboedrice de zinc-insulina (componenta ultralente) si 30% particule de insulina amorfa (componenta semilente).

Formularea aceasta este un preparat neutru care contine tampon pe baza de acetat si un exces de zinc care se leaga la suprafata hexamerului insulinei, reducand astfel solubilitatea insulinei si, in felul acesta, se produce o incetinire a profilului timp-actiune.

Insulina Lente are o declansare a actiunii dupa 1-3 ore, activitatea maxima este intre 6-12 ore si durata actiunii revine la 18-24 ore. Ca si in cazul altor formulari, variatiile observate in ceea ce priveste profilul timp-actiune sunt datorate unor factori cum ar fi: doza, locul injectarii, temperatura si activitatea fizica a pacientului.

Capacitatea de amestecare a Insulinei Lente cu Insulina regular este limitata la amestecurile extempore care sunt utilizate imediat dupa preparare din cauza precipitarii insulinei din produsul regular datorata probabil cuplarii surplusului de zinc aflat in preparatul Lente la suprafata structurii pe hexamerice a insulinei solubile.

Formulari farmaceutice ale insulinei cu actiune prelungita

In mod curent singura insulina cu actiune prelungita disponibila este Insulina Ultralente, care este o suspensie de insulina cristalizata. Formularea contine un agent de tamponare cu valoare neutra a pH-ului si un surplus de zinc.

Insulina Ultralente are o declansare a actiunii la 4-6 ore, o activitate maxima cuprinsa intre 8-20 ore si o durata actiunii situata intre 24-28 ore. Ca si celelalte formulari, variatiile profilului timp-actiune sunt datorate unor factori cum ar fi: doza, locul injectarii, temperatura,  activitatea fizica a pacientului.

Amestecarea preparatului de Insulina Ultralente cu Insulina regular este limitata la amestecarea extempore si utilizarea imediata.

Statutul comercial al preparatelor cu insulina umana recombinata

Insulina umana recombinata se prezinta pe piata farmaceutica, in mod obisnuit, in flacoane de 10 ml.

In S.U.A. concentratia de 100 U/ml reprezinta concentratia standard, in timp ce in afara Statelor Unite se folosesc doua concentratii, respectiv 100 U/ml (U-100) si 40 de U/ml (U-40).

In tabelul 3.III. sunt prezentate preparatele comerciale existente in prezent in Romania.

Preparate comerciale cu insulina

In ceea ce priveste nomenclatura atribuita amestecurilor diferitelor tipuri de insulina trebuie mentionat ca aceasta poate varia dependent de tara in care se comercializeaza si de farmacopeea tarii respective.

In Statele Unite, de exemplu, forma predominanta este NPH/Regular in raport 70/30, iar in Europa aceeasi formulare apare ca Regular/NPH in raport 30/70 (Soluble/Isophane) ingredientul de baza ("normal") fiind prezentat primul. La ora actuala se fac eforturi pentru standardizare in toata lumea a nomenclaturii Europene.

Amestecurile de insulina existente in Statele Unite includ amestecul NPH/Regular in proportiile: 70/30 si 50/50 in timp ce in Europa se gasesc amestecuri Regular/NPH in mai multe variante de proportii: 10/90, 20/80, 30/70, 40/60 si 50/50.

  Recombinarea genetica in obtinerea medicamentelor cu interferoni

Aspecte generale privind sistemul interferonic

Descoperirea interferonilor in 1957, de catre cercetatorii englezi Aleck Isaacs si Jean Lindenman a deschis calea unor indelungate si importante cercetari biochimice si medicale asupra sistemului interferonic. Denumirea de 'interferon' (IFN) deriva de la fenomenul de interferenta virala observat de catre cei doi cercetatori englezi.

Initial interferonii au fost definiti ca substante proteice, elaborate de catre celule ca raspuns la infectia virala si care au proprietatea de a transfera altor celule rezistenta la agentul viral respectiv sau la alte virusuri.

Evidentierea capacitatii leucocitelor umane de a sintetiza IFN (K.Cantell si col.), ca si a proprietatilor antitumorale ale IFN (I.Gresser) au impus reconsiderarea interferonilor ca un sistem biologic complex.

In 1986 Fradelizi includea interferonii in grupa imunohormonilor sau a limfokinelor, pe baza proprietatii acestora de efectori celulari.

In conceptia actuala, interferonii reprezinta un grup de biomolecule care fac parte din familia mare a substantelor responsabile de comunicarea intercelulara numite citokine si care au rol in special in apararea antivirala, in modularea raspunsului imun, in controlul proliferarii si diferentierii celulare.

 Structura chimica a interferonilor. Tipuri de interferoni

Din punct de vedere structural, interferonii sunt glicoproteine ce cuprind 146-166 aminoacizi si lanturi polizaharidice cu acizi sialici terminali.

Interferonii prezinta specificitate de specie si in cadrul unei anumite specii animale exista mai multe forme de IFN diferite prin antigenitate, masa moleculara (de la 15 la 1000 kD), grad de glicolizare. Masa moleculara a interferonilor umani este cuprinsa intre 17kD si 23kD.

La om exista mai multe tipuri de interferoni: alfa, beta, gama, tau si omega. Cromozomul 9 contine genele pentru IFN alfa, beta, tau si omega, iar cromozomul 12 pentru IFN gama. Sunt cunoscute in prezent o diversitate de tipuri si subtipuri de interferon mai ales pentru IFN alfa. Explicatia acestei diversitati ar putea fi legata de specificitatea diferitelor virusuri care au agresat celula de-a lungul filogeniei.

Interferonii β prezinta analogie structurala si imunologica cu interferonii α (o treime din molecula lor este comuna).

Interferonii g au proprietati citotoxice si cea mai puternica activitate antitumorala. Acestia sunt diferiti de interferonii α si β si apropiati de limfokinele de tip interleukine.

 Biosinteza interferonilor. Inductorii interferonilor

Referitor la biosinteza IFN exista doua ipoteze. Prima ipoteza se refera la faptul ca celulele produc cu o rata constanta un prointerferon, iar inductia ar consta in stimularea formarii unui sistem activator care converteste prointerferonul in interferon activ. In a doua ipoteza interferonul este produs de novo. Informatia genetica pentru sinteza lui se gaseste in patrimoniul ereditar al celulelor, insa in mod normal sinteza lui este represata.

S-a dovedit experimental ca semnalul pentru inductia de interferon este ARN bicatenar si dublu spiralat, forma care apare in ciclurile de reproducere ale virusurilor animale. Acesta actioneaza ca un derepresor neutralizand represorul specific al sintezei de IFN. Factorul determinant al inductiei este structura insasi a moleculei de ARNm si nu informatia genetica pe care acesta o contine.

Formarea IFN are loc dupa contactul celulelor cu inductorii pentru IFN, care pot fi virali (virusuri, acizi nucleici, poliribonucleotide sintetice) sau non-virali (unele pirimidinone, unele antrachinione si fluorinone).

Unii autori clasifica inductorii interferonului in:

- inductori universali, activi asupra majoritatii celulelor (leucocite, fibroblasti, celule epiteliale) si care sunt: virusurile (in special virusul Sendai si virusul Newcastle), unele bacterii, acizii nucleici bicatenari, unele poliribonucleotide si polimeri anionici;

- inductori speciali, care actioneaza numai asupra anumitor celule (celule NK - natural killer si limfocite) si care sunt: celulele infectate de virusuri, celulele tumorale, antigenele si mitogenele.

Receptorii celulelor tinta pentru interferon

Dupa anul 1980, existenta receptorilor membranari specifici pentru IFN.

Au fost identificate doua tipuri de receptori pentru IFN:

- tipul I, comun interferonilor α si β, care este o glicoproteina cu M=100kD; sinteza sa este sub dependenta unor gene de pe cromozomul 21.

- tipul II, care este specific pentru IFN γ; sinteza sa este dependenta de cromozomii 6 si 21.

Legarea interferonului g de receptorul sau specific fiind inhibata partial prin IFN β, s-a postulat existenta si a unui al treilea tip de receptor (β si γ). Numarul receptorilor pe celula variaza in cazul limfocitelor de la sute pana la 50.000-100.000, cele mai multe celule posedand 1000-2000 de receptori pentru IFN.

 Mecanisme biochimice de actiune ale interferonilor

S-au propus doua mecanisme pentru explicarea modului de actiune a interferonului la nivel celular. Un mecanism se refera la faptul ca stabilirea legaturii IFN - receptor este insotita de un proces de internalizare prin endocitoza, asociat cu o serie de reactii celulare (sinteza de proteine antivirale si inhibitoare ale cresterii). Al doilea mecanism presupune ca prin legarea interferonului de receptor se declanseaza un semnal (mesager secund AMPc sau GMPc) care actioneaza asupra genomului celular si antreneaza astfel raspunsul celular.

 Activitatile biologice evidentiate la interferoni

Efectele biologice complexe ale interferonilor, stau la baza principalelor actiuni care au fost puse in evidenta pentru IFN: antivirala, imunomodulatoare, antiproliferativa si antitumorala.

 Actiunea antivirala a interferonilor

IFN-ul sintetizat de o celula infectata printr-un virus nu are actiune asupra celulei care l-a produs, ci asupra celulelor vecine inca neinfectate.

Activitatea antivirala a celulei infectate este foarte puternica, rapida, nespecifica pentru un virus, dar este tranzitorie si dependenta de doza

 Activitatea imunomodulatoare a interferonului

IFN exercita efecte importante si complexe asupra unui numar de raspunsuri imunitare in vivo si in vitro, fiind implicate imunitatea umorala si celulara.

Imunitatea umorala

Aceasta actiune este dependenta de doza si de momentul administrarii IFN in raport cu antigenul. Astfel cand antigenul este introdus dupa IFN, productia de anticorpi este inhibata, iar cand antigenul este administrat inainte de IFN, raspunsul este variabil in functie de doza: cresterea sintezei de anticorpi la doza mica de IFN si inhibarea sintezei acestora la doza mai mare de IFN.

Imunitatea celulara

Actiunea IFN la nivelul celulei din sistemul imunitar este variabila, complexa si diferentiata pe tipuri de celule.

Actiunea antiproliferativa si antitumorala a interferonilor

Actiunea antiproliferativa se exercita deopotriva asupra celulelor tumorale cat si asupra celulelor normale; Actiunea antiproliferativa este reversibila la intreruperea tratamentului si depinde de: doza, tipul histologic al tumorii, tipul de interferon. Cea mai puternica activitate antiproliferativa apartine interferonului γ, intre diferitele tipuri de IFN existand un sinergism de actiune.

IFN actioneaza in special aspra tumorilor cu crestere lenta. Celulele tumorale cele mai sensibile la IFN sunt aceleasi cu cele mai sensibile la alti agenti citotoxici.

Recombinarea genetica in obtinerea interferonilor. Tehnologii de obtinere a interferonilor

Initial, tehnicile de obtinere pentru IFN s-au bazat, pe producerea lui in culturi celulare (de leucocite, fibroblasti si limfocite transformate).

Tehnici de producere a interferonilor leucocitar, fibroblastic si imun

Varianta producerii lor prin tehnologia ADN recombinat, a rezolvat problema calitatii cat si a costului.

S-au conturat trei principale variante de obtinere pe scara industriala:

a)  obtinerea interferonilor cu ajutorul bacteriilor cu genom modificat (procedeul Biogene)

b) obtinerea interferonilor cu ajutorul drojdiilor (procedeul Genentech Inc.)

c)  obtinerea interferonilor cu ajutorul viermilor de matase (procedeu japonez).

Obtinerea interferonilor alfa cu ajutorul bacteriilor modificate

Varianta de obtinere a interferonului alfa cu ajutorul bacteriilor modificate a fost aplicata in practica inca din anul 1980 la firma internationala Biogen. In esenta, procedeul se bazeaza pe construirea unui ADN recombinat din gena interferonului si un vector, plasmida pBR 322, care introdus in celula de E. coli susa X1776, determina sinteza interferonului.

Principalele etape ale procesului tehnologic sunt:

- izolarea unui ARN mesager specific pentru tipul de IFN de interes. Izolarea se face cu ajutorul enzimelor de restrictie din celule de leucocite activate prin tratare cu virusul Sendai, ca inductor;

- sinteza genei interferonului leucocitar prin ADN complementar obtinut pe cale enzimatica folosind enzima virala reverstranscriptaza si enzima ADN polimeraza;

- insertia genei sintetizate intr-o plasmida de E. coli, cu obtinerea unui ADN recombinat (sudarea genei este realizata cu ajutorul unei ligaze specifice);

- reintroducerea plasmidei hibride in E.coli;

- multiplicarea E. coli in cultura + producerea de IFN;

- extractia si purificarea IFN cu ajutorul anticorpilor monoclonali.

Se obtine astfel un interferon alfa recombinat cu activitate identica omologului sau endogen si de inalta puritate, care poate fi folosit pentru prepararea formelor farmaceutice comercializate. Interferonul produs de bacteriile E. coli are o activitate specifica, asemanatoare celui produs de leucocite, inducand in celulele umane starea de rezistenta la infectia virala. Din punct de vedere structural, interferonul sintetizat de E. coli difera de cel leucocitar fiind neglicozilat, celula bacteriana neavand capacitatea de a realiza glicozilarea proteinelor. Cu toate acestea, se considera ca activitatea biologica (clinica) a interferonului produs de bacterie este asemanatoare, daca nu chiar identica, cu cea a interferonului leucocitar uman.

 Obtinerea interferonilor cu ajutorul drojdiilor (procedeul Genentech Inc.)

Procedeul se bazeaza pe utilizarea plasmidelor de exprimare genica special construite pentru a putea exprima, multiplica si secreta interferonul produs de drojdii (Hitzeman si colaboratorii, 1983). Plasmidele construite sunt capabile sa dirijeze sinteza interferonilor (IFN) umani, IFN α_1, IFN α_2, IFN γ in drojdia Saccharomyces cerevisiae. Plasmidele construite pentru sinteza si secretia interferonilor umani au derivat din plasmida denumita YEpIPT. Aceste plasmide trebuie sa contina urmatoarele fragmente nucleotidice:

- fragmentul promotorului fosfogliceratkinazei (PGK) care asigura transcrierea eficienta a genei inserate (a interferonilor);

- o parte din vectorul pBR 322, continand originea replicarii (ori) si genele de rezistenta la tetraciclina (Tc^r) si ampicilina (Ap^r), ceea ce asigura cresterea, mentinerea si selectia in bacteria E. coli;

- gena triptofanului (trp 1) din cromozomul 4 al drojdiei, care permite selectia plasmidei din mutanti trp 1 cultivati in mediu fara triptofan;

- originea replicarii plasmidei din drojdie, care permite replicarea automata a plasmidei YepIPT in celulele de drojdie cultivate in mediu lipsit de triptofan;

- semnalul pentru terminarea transcrierii;

- locul pentru insertia genei interferonului, reprezentat de secventele de clivare specifice enzimei de restrictie Eco RI.

Genele interferonilor α1, α2 si γ, inainte de a fi inserate in vector, sunt astfel prelucrate incat sa poata asigura si secretia interferonilor sintetizati in mediul de cultura. Pentru transformare s-au folosit tulpinile de drojdie 20B12 si GM3C.

Dupa cultivare, celulele din extractele de drojdie au fost recoltate prin centrifugare. Au fost apoi resuspendate intr-un mediu format din: sorbitol, fosfat monopotasic si zimoliaza si s-au incubat 30 minute la 30˚C. In urma acestui tratament 90% din peretele celular se indeparteaza. Particulele sferice obtinute au fost centrifugate si resuspendate in clorhidrat de guanidina si diluate in tampon fosfat salin, continand albumina serica bovina.

 Obtinerea interferonilor cu ajutorul viermilor de matase

Procedeul, pus la punct de Maeda in Japonia, se bazeaza pe utilizarea unui ADN recombinat, construit din genomul virusului poliedrozei nucleare si genele interferonilor umani. Cu acest ADN recombinat se realizeaza infectarea viermilor de matase, care produc apoi cantitati mari de interferoni. Izolarea si codificarea interferonilor se face relativ simplu din hemolimfa viermilor de matase, care in paralel continua si secretia de matase. Prin acest procedeu se produce IFN α, dar el poate fi utilizat si la obtinerea interferonilor de tip β si γ.

Statutul comercial al produselor farmaceutice cu interferon uman recombinat (rHuIFN)

Medicamente cu interferon α uman recombinat. Descrierea chimica. Caracteristici comune si diferentiale pentru interferonul recombinat α-2a si α-2b

Pe piata farmaceutica exista o gama variata de forme sistemice ale interferonului α: versiunile recombinate ale unui subtip specific de interferon α dar si amestecuri purificate cu interferon α natural de origine umana. Familia naturala a interferonului α consta din cel putin 14 subtipuri diferite.

Clonarea recombinata a unei singure gene a interferonului α permite obtinerea unuia din subtipurile specifice. Interferonul α-2a recombinat (Roferon A), care este un subtip de interferon α, consta dintr-o catena de proteina neglicozilata cu 165 de aminoacizi fiind produsa de E. coli prin inginerie genetica. Molecula are un rest de lizina la pozitia 23 a catenei proteice.

Procesul de purificare include cromatografia de afinitate cu utilizarea anticorpilor monoclonali murinici specifici pentru interferon, produsul final continand un singur subtip de interferon alfa (IFN α-2a).

Interferonul α-2b recombinat (Intron A) este un interferon α format din 165 de aminoacizi. Este produs de E. coli prin inginerie genetica si este deci o proteina neglicozilata avand un rest de arginina la pozitia 23. Produsul final contine un singur subtip de interferon α.

Interferonul α-n3 (Alferon N) este un amestec cu un grad mare de purificare constituit dintr-un numar de 14 subtipuri de interferon α uman natural. Este preparat prin izolare din leucocite umane care au fost induse prin infectie incompleta cu virusul Sendai al pasarilor; acest preparat contine catene de proteine cu aproximativ 166 aminoacizi. Procesul de preparare include purificarea prin intermediul cromatografiei de imunoafinitate cu anticorpi monoclonali murinici, apoi acidularea la o valoare de pH egala cu doi, timp de 5 zile la 4^oC si in final cromatografie prin filtrare in gel.

Interferonul α-n1 (Welferon) este un amestec de IFN α naturali obtinut de celulele limfoblastoide umane dupa inductia cu virusul Sendai. Interferonul α-n3 si α-n1 contin proteine glicozilate.

Caracteristici comune si diferentiale pentru IFN α-2a si IFN α-2b

Aspecte de farmacologie a interferonului α-recombinat

Interferonii α au activitati antivirale, antiproliferative si imunomodulatoare.

Deoarece interferonii-α sunt proteine, rezulta ca administrarea nu se face in nici un caz pe cale orala datorita distrugerii lor gastrice. Caile de administrare vor fi in cazul interferonilor α: calea intramusculara, subcutanata, intralezionala sau intraveziculara.

Concentratiile maxime plasmatice sunt atinse dupa 3 ore de la administrarea i.m. si dupa 7 ore dupa administrarea s.c. in cazul interferonului α-2a si respectiv dupa 3 ore si 12 ore in cazul interferonului α-2b recombinat. Literatura de specialitate mentioneaza de asemenea ca interferonii α sunt filtrati in totalitate prin glomerulii renali si sufera un proces de degradare in timpul reabsorbtiei in tubii renali.

 Medicamente cu interferon β uman recombinat

Caracteristici structurale pentru IFN β recombinat

Interferon β-1b este o proteina obtinuta prin inginerie genetica folosind E. coli. Gena nativa este obtinuta din fibroblasti umani. Proteina este modificata fata de IFN β natural, in sensul ca restul de cisteina din pozitia 17 este de inlocuit cu serina; nu este glicozilata.

 Efectele biologice pentru IFN β

Interferonul β poseda atat efecte antivirale cat si efecte imunomodulatoare. Activitatile interferonului β sunt specifice speciei.

 Aspecte de farmacologie pentru IFN β

Interferonul β recombinat are activitate in scleroza multipla in placi, maladie caracterizata printr-o suita de remisiuni si recaderi. Produsul Betaseron care contine interferonul β-1b recombinat a fost primul folosit in aceasta maladie, iar recent s-a aprobat si produsul Avonex care contine interferonul β-1a recombinat.

Aspecte farmaceutice si clinice privind IFN β

Reconstituirea produsului liofilizat in flacoane se face prin adaugarea de 1,2 ml de diluant (solutie de NaCl 0,54%) si trebuie sa fie folosit in decurs de 3 ore. Flacoanele, destinate unei singure utilizari, nu trebuie sa fie agitate, iar administrarea se face pe cale subcutanata.

Din 1966 a fost aprobata folosirea interferonului β-1a recombinat prin produsul Avonex in tratamentul formelor recurente ale sclerozei multiple.

 Medicamente cu interferon γ recombinat. Caracteristici de structura pentru IFN γ

O versiune recombinata pentru IFN γ este interferonul γ-1b care reprezinta principiul activ pentru produsul farmaceutic Actimmune. Din punct de vedere chimic IFN γ-1b este o polipeptida cu o catena unica cu 140 de aminoacizi. Este produs de E. coli prin inginerie genetica, purificarea produsului obtinut facandu-se prin cromatografie pe coloana.

 Efectele biologice pentru IFN γ

Interferonul γ are activitati antivirale, antiproliferative si imunomodulatoare. Proprietatile antivirale ale interferonului γ sunt mai reduse decat cele ale interferonului-α. Interferonul γ are un efect mult mai puternic asupra celulelor fagocitice comparativ cu IFN α sau β.

IFN γ, in mod natural este produs de celulele T stimulate de antigen precum si de celulele NK. Prin cuplare cu receptorii de pe suprafata celulelor tinta, IFN γ induce activarea macrofagelor si monocitelor, aflate in stare de repaus, intervenind in producerea intracelulara a metabolitilor toxici ai oxigenului din aceste celule, folositi ca arme de aparare contra agentilor patogeni.

IFN γ mareste si functia fagocitarta a granulocitelor, cum ar fi neutrofilele si monocitele. Dupa expunerea la IFN γ aceste celule au capacitate sporita de a produce anionul superoxid care ajuta la eliminarea patogenilor care au fost fagocitati.

 Indicatii terapeutice pentru IFN γ recombinat

Interferonul γ are eficacitate in tratamentul granulomatozei cronice care este o tulburare mostenita, caracterizata printr-o deficienta a metabolismului oxidativ fagocitic. In cadrul unui studiu controlat prin placebo facut pe pacienti care sufereau de granulomatozei cronice s-a demonstrat ca produsul Actimmune, care contine IFN γ-1b, a redus semnificativ incidenta infectiilor grave precum si perioadele de spitalizare. Deci indicatia acceptata pentru IFN γ-1b este aceea de a reduce frecventa si gravitatea infectiilor grave asociate cu maladia granulomatoasa cronica. S-ar parea ca acest produs este eficace pentru toate tipurile genetice ale acestei maladii.

 Aspecte farmaceutice si clinice pentru IFN γ recombinat

Interferonul γ-1b poate fi formulat ca o solutie sterila, clara care contine 100 mg (3 milioane de UI) de interferon in 0,5 ml. Flacoanele cu produs sunt pentru o utilizare unica si inainte de folosire nu trebuie sa fie lasate la temperatura camerei mai mult de 12 ore.

Administrarea se face s.c. si doza recomandata pentru pacientii cu granulomatoza cronica este de 50 mg/m² (1,5 mU/m²) de trei ori pe saptamana.

 Perspective in folosirea interferonilor obtinuti prin ADN recombinat

Sunt de asemenea in studiu noi forme de administrare a IFN (forme cu eliberare prelungita, lipozomi, matrici cu polimeri biodegradabili).

Hormonul de crestere uman recombina si stomatostatina recombinata

Generalitati privind hormonul de crestere endogen uman (hGH)

Hormonul de crestere al omului (hGH - human growth hormone) este un hormon de tip proteina, esential pentru cresterea normala si pentru dezvoltarea organismelor. Se mai numeste hormonul somatotrop (STH) sau somatotropina.

hGH influenteaza multe aspecte ale metabolismului uman printre care: stimularea procesului de lipoliza, stimularea sintezei proteinelor, inhibarea metabolismului glucozei.

Acest hormon a fost izolat si identificat in jurul anului 1950 din extracte obtinute din glandele pituitare (hipofiza anterioara), glande care la randul lor au fost recoltate de la cadavre sau de la pacienti care fusesera supusi hipofizectomiei. Primele utilizari -1957-58 pentru stimularea cresterii copiilor hipopituitari Clonarea hormonului uman al cresterii a avut loc pentru prima data in 1979, iar prima utilizare la oameni a hormonului de crestere recombinat (rhGH) a fost comunicata in literatura de specialitate in 1982.

Creutzfeldt-Jakob, - hGH derivat din glanda pituitara. -contaminarea posibila a preparatelor de hGH obtinute din glanda pituitara, cu "prion'-ul - scoaterea acestor produse de pe piata comerciala din S.U.A., in 1985 ca urmare rhGH.

Preparate pe baza de rhGH au fost produse la inceput de catre bacterii (E. coli) si spre deosebire de hGH endogen au continut o grupare de metionina terminala si a fost notat met- rhGH.

Produsele care contineau rhGH cu secventa naturala au fost obtinute ulterior atat in celulele bacteriilor cat si in celulele mamiferelor.

Structura hormonului de crestere endogen uman si izohormonii hGH

Forma principala circulanta a hormonului de crestere uman (hGH) este o proteina neglicozilata cu 22 kD compusa din 191 resturi de aminoacizi care sunt legate prin punti de disulfura, formandu-se doua bucle peptidice.

Hipofiza anterioara secreta mai multe izoforme de hormoni de crestere principale fiind: monomerul cu 22 kD si monomerul cu 20 kD.

La oameni exista doua gene hGH notate: gena hGH-N si gena hGH-V. Gena hGH-N este exprimata in glanda pituitara si este direct raspunzatoare de producerea formei cu 22 kD, "normale", a hormonului de crestere endogen uman.

Gena hGH-V (gena variabila) este exprimata in placenta si este direct raspunzatoare de producerea unor forme 'variabile' de hGH intalnite in cantitati mari la femeile insarcinate in cursul celui de al treilea trimestru de sarcina.

 Secretia si reglarea secretiei hormonului de crestere uman

Hormonul de crestere hipofizar este stocat in hipofiza anterioara sub forma legata de ioni de zinc fiind eliberat din aceasta forma in urma secretiei acestuia in plasma. Aproximativ 40% din hormonul de crestere secretat se leaga in plasma de proteine specifice numite GHBP (growth hormone binding proteins), proteine care leaga hormonul de crestere. Aceste proteine sunt de doua feluri: cu afinitate mare pentru hormon si cu afinitate redusa.

Cedarea hormonului de crestere din glanda pituitara e reglata prin feedback scurt de doua peptide hipotalamice cuplate si anume o peptida stimulatoare, hormonul care stimuleaza eliberarea hormonului de crestere (GH-RH - growth hormone releasing hormone) numita si somatoliberina si o peptida inhibitoare, somatostatina notata cu GH-RIH - growth hormone releasing inhibitor hormone.

Factorii care influenteaza secretia de hGH sunt:

- factori hormonali dintre care unii sunt stimulatori (somatoliberina hipotalamica, estrogenii, glucagonul, vasopresina), iar altii sunt inhibitori (somatostatina, hipotiroidismul);

- factori metabolici dintre care unii sunt stimulatori (starea de foame, aminoacizii plasmatici, uremia crescuta) si altii sunt inhibitori (hiperglicemia, nivel crescut de acizi grasi liberi in sange);

- factori neurali dintre care unii sunt stimulatori (somnul, stresul de tipul traumatismelor, emotiilor, infectiile diverse, agonisti α-adrenergici, antagonisti β-adrenergici, L-DOPA, iar altii inhibitori (agonistii β-adrenergici, agonisti α-adrenergici).

Actiunile biologice ale hormonului de crestere

Hormonul de crestere are actiuni metabolice si de promovare a cresterii care sunt bine definite. Astfel hGH stimuleaza cresterea cartilajelor si oaselor in mod direct, prin intermediul receptorilor sai prezenti in aceste tesuturi si indirect prin intermediul cresterilor locale ale concentratiei de IGF-I numit si somatomedina.

 Obtinerea hormonului de crestere uman recombinat (rhGH)

Productia de hormon de crestere prin inginerie genetica are si un interes istoric, fiind rezultatul practic al primului contract care are la baza 'comercializarea genei', contract industrial realizat in 1978 intre firma farmaceutica Kabi Vetrum AB din Stokholm (Suedia) si firma Genentech (S.U.A.) specializata in construirea de microorganisme modificate prin inginerie genetica.

Interesul medical pentru acest hormon consta in faptul ca absenta lui din organism determina aparitia nanismului, maladie care poate fi vindecata prin administrare de hormon.

In mod normal, hormonul de crestere uman (care este un polipeptid continand 191 de aminoacizi) este elaborat de catre tesuturile glandei pituitare. Intrucat are specificitate de specie, sursa naturala de extragere a fost glanda umana provenind de la cadavre, sursa care este foarte limitata si deci s-au obtinut cantitati foarte mici. Tratamentul cu hormon in cazul nanismului hipofizar implica doua injectii saptamanale a cate 2 mg. fiecare, incepand de la 4 - 5 ani, pe toata perioada pubertatii, costul pentru un an al tratamentului unui copil ridicandu-se la 10.000 dolari.

Din fericire, tehnologia ADN recombinat a oferit o posibilitate avantajoasa pentru producerea hormonului de crestere uman, marind sansa de a trata numerosi copii afectati de aceasta maladie. In sapte ore, dintr-un litru de cultura bacteriana, se obtine cantitatea de hormon care s-ar putea extrage prin metodele anterioare pornind de la 60 de glande hipofizare.

Procedeul industrial de sinteza al hormonului de crestere uman se bazeaza pe utilizarea unei tulpini de E. coli modificata prin tehnologia ADN recombinat. Gena HCU a fost obtinuta prin combinarea metodei chimice cu cea enzimatica de sinteza a ADN: prima parte a genei (care codifica aminoacizii 1 - 24) a fost sintetizata chimic prin metoda fosfotriesterilor, iar partea a doua (corespunzatoare aminoacizilor 25-191) a fost sintetizata enzimatic, utilizand ARNm specific genei HCU ca matrita, iar reverstranscriptaza ca enzima pentru obtinerea ADNcomplementar.

Pentru a marca inceputul genei, sinteza chimica a primei parti a genei a inclus si atasarea codonului ATG, care specifica sinteza metioninei. In felul acesta s-a asigurat startul corect al sintezei genei HCU si etapa de desprindere de ß-galactozidaza.

Pe de alta parte, ADNc sintetizat pe modelul ARNm izolat din glanda pituitara a fost la randul sau modificat in asa fel incat sa contina informatia genetica doar pentru aminoacizii 25-191 ai genei HCU. In acest scop, ADNc a fost hidrolizat cu enzima de restrictie Hae III, care actioneaza asupra secventei GGCC situata in prima parte a ADNc, exact in zona codonilor care specifica sinteza aminoacizilor 24-25.

In urma hidrolizei apar doua fragmente de ADNc, unul mic care se indeparteaza, iar al doilea - cel mare - corespunzator aminoacizilor 25 - 191, este cuplat, dupa purificare, cu prima parte a genei HCU sintetizata chimic. Prin aceste operatii se ajunge in final la obtinerea genei intregi HCU.

In continuare, cu ajutorul AND-ligazei, gena este atasata vectorului pBR 322 prevazut cu regiunea de control a operonului lac. ADN recombinat astfel obtinut este utilizat apoi la transformarea celulelor de E. coli. Celulele transformate produc gena HCU sunt izolate si prelucrate pentru a produce substanta proteica.

 Preparate farmaceutice cu hormon de crestere uman

Utilizarea clinica a preparatelor farmaceutice cu hormon de crestere uman recombinat

In continuare prezentam unele informatii privind principalele indicatii clinice ale hormonului de crestere uman recombinat.

A. Deficienta in hormon de crestere/statura idiopatica mica

B. Sindromul Turner

Sindromul Turner este o maladie intalnita, mai ales, la femei si care este cauzat de pierderea partiala sau totala a unui cromozom sexual si caracterizata printr-o scadere a cresterii intrauterine si postnatale, inaltime finala mica a adultului, dezvoltarea incompleta a ovarelor si a caractererelor sexuale secundare precum si prin alte anomalii fizice.

C.Insuficienta renala cronica (IRC)

Copii care prezinta aceasta insuficienta renala cronica cresc greu, probabil datorita deficientelor de metabolism.

D.Deficiente de hormon de crestere la adulti si varstnici

F. Sindromul malnutritiei si sindromul pierderii in greutate

G.Alte indicati clinice ale rhGH

terapii ale sterilitatii femeilor.

vindecarii ranilor si arsurilor

Efecte adverse ale administrarii hormonului de crestere uman recombinat

Fenomene adverse au fost observate doar in cazul unui numar mic de copii si au inclus: hipertensiunea craniana, intoleranta fata de glucoza si formarea de anticorpi anti-hGH. aparitia leucemiei, dar nu s-a stabilit o corelatie definita.

Hormonul de crestere a produs retentia semnificativa a lichidelor la pacientii adulti, ceea ce a condus la cresterea greutatii corpului, umflarea articulatiilor, artralgii si alte simptome. Aceste simptome au fost trecatoare, disparand odata cu reducerea dozelor de rhGH sau dupa intreruperea tratamentului.

Formularea preparatelor farmaceutice cu hormon de crestere uman recombinat

Activitatea produselor cu rhGH a fost exprimata in Unitati Internationale/mg (UI/mg). Etalonul sau standardul initial stabilit in 1982 pentru preparatele pit-hGH a fost egal cu 2 UI/mg. Standardul pentru produsele cu rhGH a fost de 2,6 UI/mg pana in septembrie 1994. Etalonul curent, stabilit in septembrie 1994 este egal cu 3,0 UI/mg.

Majoritatea formularilor curente se prezinta sub forma de preparate liofilizate care trebuie sa fie reconstituite inainte de injectare. Formularile liofilizate includ de obicei 5 sau 10 mg de proteina biologic activa incorporata intr-un excipient care este constituit dintr-un tampon fosfat, glicocol si/sau manitol.

Preparatele sunt reconstituite de obicei cu apa sterila pentru injectii in vederea unei singure utilizari sau cu apa sterila sau solutie salina bacteriostatica in vederea mai multor administrari.

Recent a fost aprobat in vederea utilizarii in SUA un preparat lichid cu rhGH (Nutropin AQ, Genentech Inc.) care contine 10 mg de proteina in tampon citrat continand si polisorbat 20, fenol, clorura de sodiu.

 Obtinerea somatostatinei prin recombinare genetica. Generalitati. Raspandire in organismul uman.

Somatostatina a fost descrisa initial ca factor hipotalamic care inhiba eliberarea somatotropinei hipofizare (GH-RIH sau SRIH). Ulterior somatostatina a fost identificata si in pancreas, unde este produsa de celule de tip D insulare, la nivelul tractului gastrointestinal precum si in creier.

La fel ca majoritatea hormonilor cu structura polipeptidica, somatostatina este elaborata sub forma unui precursor cu greutate moleculara relativ mare, care se transforma in cele doua forme active ale somatostatinei (cu 14 si respectiv 28 de aminoacizi).

 Structura chimica

Somatostatina este un hormon local care se prezinta sub doua forme active ciclice:

-cu 14 aminoacizi (tetradecapeptid)

-cu 28 aminoacizi

 Somatostatina 14

S S

Ala- Gly- Cys- Lys- Asn- Phe- Phe- Trp- Lys- Thr- Phe- Thr- Ser- Cys

Somatostatina 28

Ser-Ala-Asn-Ser-Asn-Pro-Ala-Met-Ala-Pro-Arg-Glu-Arg-Lys-Ala-Gly-

-Cys-Lys-Asn-Phe-Phe-Trp-Lys-Thr-Phe-Thr-Ser-Cys

S S

Forme active ale somatostatinei (SRIH)

 Actiuni biologice si farmacologice

Somatostatina hipotalamica prin actiune paracrina moduleaza secretia unor hormoni sintetizati de catre hipofiza. Astfel, somatostatina din hipotalamus inhiba eliberarea hormonului de crestere hipofizar (hormonul somatotrop hipofizar, STH, GH).

Tot prin actiune paracrina somatostatina pancreatica inhiba secretia de glucagon si insulina precum si secretiile exocrine ale pancreasului.

La nivelul tractului gastrointestinal, somatostatina inhiba secretia de gastrina, de acid clorhidric, pepsina.

La nivelul creierului cele doua neuropeptide active: somatostatina 14 si somatostatina 28 au actiuni biologic mai putin cunoscute (probabil ca neurotransmitatori)

 Obtinerea somatostatinei prin biotehnologie

Izolarea somatostatinei din hipotalamus sau din alte tesuturi este deosebit de dificila; Guillemin (descoperitorul acestui hormon) a trebuit sa prelucreze jumatate de milion de creiere de oaie pentru a obtine 1 mg de somatostatina.

In urma cercetarilor efectuate de colectivul condus de Guillemin, care au stabilit structura primara a somatostatinei (cei 14 aminoacizi constitutivi), s-a dedus structura genei somatostatinei, in baza echivalentelor stabilite de codul genetic.

Trebuie precizat ca pentru o anumita secventa de aminoacizi se pot formula mai multe structuri pentru gena corespunzatoare, intrucat codul genetic este degenerat, iar unul si acelasi aminoacid poate fi codificat de mai multi codoni. In acest caz, alegerea codonilor s-a facut pe baza unor observatii experimentale, care au precizat preferinta sistemului celular de E. coli de a exprima anumiti codoni.

Itakura si colaboratorii au sintetizat gena somatostatinei din 8 blocuri de oligodeoxinucleotide monocatenare obtinute prin metoda fosfotriesterilor. Sinteza a inclus si atasarea nucleotidelor corespunzatoare pentru situsul enzimei de restrictie Eco RI si nucleotidele codonului de start (ATG), iar la capatul genei s-au adaugat nucleotidele pentru doi codoni de stop, plus nucleotidele pentru situsul enzimei de restrictie Bam HI.

Gena asamblata a fost cuplata de vectorul de exprimare construit din plasmida pBR 322 si elementele de reglaj ale operonului lac. Orientarea corecta a genei a fost asigurata de existenta in vector a doua capete coezive, primul format din nucleotide ce constituie jumatate din situsul enzimei Eco RI, iar al doilea din nucleotidele specifice pentru jumatate din situsul enzimei Bam HI.

Cu ADN recombinat astfel obtinut s-a facut transformarea celulelor de E. coli. In celulele transformate se sintetizeaza somatostatina fuzionata cu b-galactozidaza. Tratarea cu BrCN a acestui complex izolat din celule, permite obtinerea somatostatinei pure, care s-a dovedit a fi, din punct de vedere structural si biologic, identica cu hormonul produs de hipotalamusul uman.

Referitor la obtinerea somatostatinei umane cu ajutorul bacteriilor modificate, este de mentionat ca in acest caz s-a reusit sa se dovedeasca pentru prima data ca o gena umana, proiectata si sintetizata de om, se poate exprima corect si eficient intr-un sistem bacterian.

 Produse farmaceutice cu somatostatina

Datorita faptului ca somatostatina inhiba secretia hormonului de crestere, a insulinei si a glucagonului, ea este din ce in ce mai utilizata ca un agent terapeutic eficace in tratamentul acromegaliei, pancreatitei acute si in special a diabetului insulino-dependent.

Medicamentul Stilamin, comercializat de firma Serono, contine acetat de somatostatina 14, un tetradecapeptid ciclic obtinut sintetic, identic ca structura si actiune cu somatostatina endogena.

Este indicat in tratament curativ in hemoragii severe cauzate de ulcere gastrice si duodenale sau varice esofagiene, hemoragii severe care insotesc gastrita acuta eroziva sau gastrita hemoragica si in tratament profilactic pentru prevenirea complicatiilor post-operatorii din chirurgia pancreatica. Ca tratament adjuvant este folosit in cetoacidoza diabetica.