|
|
|
METODE DE CULTIVARE A BACTERIILOR
Cunoasterea necesitatilor nutritive ale bacteriilor este foarte importanta in bacteriologia medicala, deoarece sta la baza prepararii mediilor de cultura destinate izolarii diverselor specii bacteriene din produsele biologice sau patologice.
La inceputurile dezvoltarii bacteriologiei, prepararea mediilor a fost artizanala, numerosi bacteriologi intrand in istoria microbiologiei prin mediile pe care le-au preparat si care le poarta si astazi numele. Astfel, amintim, de exemplu, mediul Loeffler pentru cultivarea bacilului difteric, mediul Löwenstein-Jensen pentru bacilul lui Koch, mediul selectiv Wilson-Blair pentru salmonele si multe altele.
Prin cercetarea necesitatilor nutritive ale diferitelor specii s-au realizat medii adecvate pentru aproape toate bacteriile de interes medical, speciile necultivabile fiind foarte putine, ca, de pilda, Mycobacterium leprae si unele spirochete printre care Treponema pallidum.
Cultivarea bacteriilor in scop diagnostic pune in esenta doua probleme:
alegerea unui mediu de cultura optim, care sa permita izolarea tuturor bacteriilor care ar putea fi prezente in produsul de examinat si
obtinerea bacteriilor in culturi pure, pentru a putea fi identificate.
6.1. Conditii generale pentru cultivarea bacteriilor
Un mediu de cultura uzual trebuie sa contina apa, substante organice, minerale, oligoelemente si factori de crestere. Pentru satisfacea acestor necesitati se ultilizeaza diferite substraturi biologice nutritive complexe care au in compozitia lor aceste ingredinente. Astfel:
- peptonele, care se obtin prin hidroliza enzimatica sau acida a proteinelor de origine animala (de exemplu faina de oase). Ele nu au o compozitie chimica foarte bine definita, iar prin continutul in peptide si aminoacizi constituie o sursa universala de azot, pentru toate bacteriile cultivabile, fiind folosite practic in prepararea tuturor mediilor de cultura,
- extractul de carne, ce se obtine prin deshidratarea decoctului de carne de vita. Acesta contine cantitati importante de creatina, xantina, hipoxantina, acid uric, acid adenilic, glicocol, uree, glutamina ca sursa de azot precum si glicogen, hexozofosfati, acid lactic etc. ca sursa de carbon,
- extractul de drojdie, care se obtine prin cultivarea controlata a drojdiilor si care contine numeroase vitamine, mai ales cele din grupul B,
In afara de ingredientele mai sus mentionate mai amintim:
- clorura de sodiu, care se adauga la mediile uzuale intr-o concentratie de 0,9%. Pentru cultivarea bacteriilor halofile concentratie poate creste pana la 10%,
- mono sau polizaharidele, unii alcooli (glicerina, manitol) pot inmbogati mediile, deoarece constituie surse de carbon usor accesibile multor bacterii,
Cultivarea microbilor pe medii lichide. Mediile lichide se folosesc cel mai adesea pentru inmultirea unor microbi care se gasesc in numar mic intr-un anumit produs. Cel mai simplu mediu folosit in laboratorul de bacteriologie este bulionul care se prepara din decoct de carne de vaca, peptona si clorura de sodiu. Cultivarea unui produs pe medii lichide are dezavantajul ca nu permite insa obtinerea unei culturi pure.
Caracterele culturale ale microbilor pe medii lichide difera. Astfel, bacteriile apartinand familiei Enterobacteriaceae tulbura uniform mediul, altele, ca de pilda bacteriile strict aerobe (Pseudomonas, Nocardia) formeaza pelicule la suprafata mediului. Altele formeaza agregate care se dezvolta sub forma de grunji ce se depun pe peretele eprubetei sau la fundul mediului (Streptococcus). Unele bacterii secreta in mediu pigmenti difuzibili ca de exemplu bacilul piocianic (Ps.aeruginosa).
Cultivarea bacteriilor pe medii solide.
Introducerea mediilor de cultura solide a insemnat un progres urias in tehnicile de diagnostic, deoarece permite dezvoltarea distincta a microbilor, sub forma de colonii izolate. O colonie bacteriana este o micropopulatie ce rezulta din inmultirea unui singur microb pe un mediu, vizibila in general cu ochiul liber.
Figura 19 - Colonii izolate
Cel mai simplu mediu solid este geloza simpla, ce se obtine prin adaugarea la bulion a unei substanta gelificabile, care de regula este geloza, un polizaharid obtinut din alga marina agar-agar. La aceast mediu simplu se pot adauga diferite ingrediente (sange de oaie, ser, ascita, extract de drojdie etc.) pentru a putea cultiva bacteriile pretentioase.
Caracterele culturale sunt foarte importante in identificarea microbilor. Ele se apreciaza fie cu ochiul liber, fie cu ajutorul unei lupe. Elementele ce se descriu, in general, sunt dimensiunea, forma, pigmentul, consistenta, aderenta la mediu, activitatea hemolitica si unele modificari pe care microorganismele le produc in mediul respectiv.
Coloniile cu aspect neted, cu marginile regulate si care se suspenda omogen in ser fiziologic se numesc colonii de tip S (smooth), pe cand coloniile aceleiasi specii, cu suprafata rugoasa, relief si margini neregulate si care aglutineaza sponatan in ser fiziologic - colonii de tip R (rough). In general, cu unele exceptii, coloniile S apartin tupinilor virulente, pe cand cele R sunt nevirulente.
Cultivarea microbilor pe medii solide permite, de asemenea, numaratoarea de germeni intr-un anumit produs. Acest aspect este deosebit de important deoarece in multe infectii criteriul de implicare etiologic este numarul bacteriilor in produsul de examinat (infectii urinare).
Medii speciale. Exista situatii in care izolarea unui microb necesita medii deosebite care sa favorizeze selectarea lui din produse intens contaminate.
Mediile de imbogatire sunt medii lichide care permit inmultirea preferentiala a unui microb dintr-un amestec. Astfel sunt mediile cu continut mare de clorura de sodiu (1-10%) in care se pot dezvolta numai bacterii halofile ca, de exemplu, stafilococul (mediul Chapmann lichid) si enterococul. Unele medii de imbogatire au ca factor electiv anumite substante, ca, de exemplu, selenitul acid de sodiu, care permite dezvoltarea salmonelelor din materiile fecale. Alte medii se bazeaza pe propietatea unor germeni de a se dezvolta la un pH mai acid sau mai alcalin decat majoritatea speciilor bacteriene de interes medical. Astfel, vibrionul holeric se dezvolta la un pH alcalin (9) iar brucelele la la un pH acid (6).
Medii selective. Daca un mediu de imbogatire se solidifica, rezulta un mediu selectiv care are avantajul obtinerii microbilor sub forma de colonii izolate. Datorita acestor medii, izolarea si identificarea bacteriilor este astazi mult simplificata. Mediile selective, care se bazeaza pe particularitatile metabolice ale unor specii microbiene sau mai ales pe rezistenta naturala a acestora la antibiotice, sunt utilizate in mod curent in laboratoarele de bacteriologie, deoarece permit, practic, izolarea dintr-un amestec de microbi, a oricarui microb in cultura pura.
Mediile de diagnostic sunt medii de cultura care evidentiaza anumite proprietati fiziologice si caractere biochimice ale tulpinilor bacteriene pe baza carora acestea pot fi identificate. Astfel, de exemplu, numeroase specii bacteriene se recunosc pe baza zaharurilor pe care le fermenteaza. Mediile de diagnostic cu zaharuri contin zaharul de cercetat si un indicator de pH. In cazul in care bacteria insamantata in acest mediu va fermenta zaharul, culoarea mediului se va schimba dupa cateva ore datorita scaderii pH-ului.
Daca in trecut mediile de cultura se preparau in laboratoarele de bacteriologie, astazi productia lor a devenit o industrie puternica. Exista mii de firme care sunt intr-o permanenta concurenta, rezultatul fiind elaborarea unor medii de cultura din ce in ce mai performante, care usureaza si imbunatatesc asistenta medicala microbiologica.
Figura 20 - Tehnica insamantarii in vederea obtinerii coloniilor izolate
