|
|
|
UNIVERSITATEA DE MEDICINA SI FARMACIE "IULIU HATIEGANU"
SECTIA MEDICINA GENERALA
APLICABILITATEA TERAPIEI GENICE IN TRATAREA DIABETULUI ZAHARAT DE TIP 1
Rezumat
Lucrarea de fata propune o noua metoda de terapie ,care prin manipularea materialului genetic ar putea conduce la vindecarea soarecilor cu diabet zaharat de tip I.
De la soarecii sanatosi s-a extras din celulele β-pancreatice gena care codifica sinteza insulinei prin metoda PCR. Ulterior, fragmentul de ADN a fost livrat in hepatocitul soarecelui knockout cu ajutorul unor vectori virali(adenovirusuri) si non-virali (liposomi). Am urmarit transformarea celulelor hepatice in celule secretoare de insulina.
Vectorii au fost introdusi in organismul gazda prin injectarea lor in ramura stanga a venei porte dupa evidentierea acesteia cu o substanta de contrast.
Pentru a verifica daca a avut loc exprimarea genei in celulele hepatice am admistrat o doza crescuta de glucoza per os urmarind periodic nivelul glicemic. In final am observat un raspuns pozitiv din partea organismului, adica reglarea glicemiei prin secretie de insulina.
Scopul lucrarii: investigarea unor noi metode prin care diabetul zaharat tip I poate fi ameliorat/ vindecat.
Cum ?
Utilizand terapia genica, urmarim obținerea unor celule hepatice modificate genetic, devenind astfel capabile sa secrete insulina.
Am
avut la baza lucrarii modelul experimental al doctorului Chan si colab. de la
"Baylor College of Medicine",
Partea generala
TERAPIA GENICA
Terapia genica poate fi definita drept ansamblu de metode si tehnici prin care este posibila manipularea materialului genetic la nivel celular si molecular pentru a obtine pe cai netraditionale produsi utili omului si genotipuri noi, avand la baza tehnologia moleculelor recombinate (hibride) de ADN.Exista diferite tipuri de terapie genica:
-terapie genica ce utilizeaza o gena pe care o introduce in celulele bolnave.
-terapie genica germinala sau sexuala, care consta in aplicarea terapiei genice unui embrion, in stadiul in care acesta este format dintr-o ingramadire de celule.
-terapie genica sexuala care se aplica celulelor germinale(ovule, spermatozoizi) la adult.
Terapia genica se profileaza ca directie stiintifica si tehnologica in anii '70. Aparitia ei a fost determinata, in primul rand, de aprofundarea cunostintelor de genetica la nivel celular si molecular.
Datorita cercetarilor de genetica moleculara, a fost posibila cunoasterea structurii de profunzime a unor gene si genomuri, fapt ce a condus la elaborarea tehnologiei ADN-ului recombinat si la transferul de gene peste barierele de specie. Pana in prezent sunt in curs de punere la punct doua strategii diferite:
Tehnica in vitro consta in recoltarea de celule de la individul care urmeaza sa fie
tratat (de exemplu, limfocite, printr-o simpla luare de sange) si introducerea
in ele a genelor bune fie prin transfectie (tehnica de laborator care permite
introducerea de A.D.N. intr-o celula cu nucleu), fie prin intermediul unui
virus. Aceste celule, care poseda atunci gena buna, sunt reintroduse in sange
printr-o injectie intravenoasa. Aceasta strategie nu poate fi utilizata decat
in cazul unor defecte genetice care se manifesta in sange sau sunt localizate
in celule pe care sangele le iriga.
- Tehnica in vivo consta, in
general, in asocierea unei gene bune cu un vector (un virus, de exemplu), care
va fi capabil sa o transporte acolo unde prezenta sa este necesara. Pentru a fi
eficace, trebuie ca aceasta sa fie in stare sa acceada specific la toate
celulele care trebuie sa fie corectate si sa patrunda in ele. Aceasta tehnica
ramane inca mai mult teoretica decat practica
Sistemele vectoriale, utilizate pentru transferul informatiei straine in celulele (organismele) - gazda, trebuie sa corespunda urmatoarelor cerinte:
inofensivitatea vectorului;
multiplicarea rapida in celula-gazda si lipsa posibilitatilor de multiplicare in celulele altor organisme;
prezenta unui numar restrans de situri de recognitie;
prezenta genelor marker pentru selectarea de clone dupa moleculele recombinate de ADN;
izolarea relativ usoara, clonarea si expresia in celulele (organismele) straine
Celulelor utilizate in experimentele ingineriei genice le sunt inaintate o serie de cerinte care au menirea de a asigura securitatea investigatiilor stiintifice. Conform "Regulilor despre molecule recombinate de ADN" celulele-gazda trebuie sa satisfaca urmatoarele cerinte:
capacitatea sporita de implicare in investigatiile stiintifice;
incapacitatea de sinteza a anvelopei protectoare in afara laboratorului;
capacitatea lizarii ADN-ului sau in afara laboratorului;
imposibilatatea transferului informatiei ereditare altor organisme;
imposibilitatea poluarii mediului inconjurator in rezultatul transformarii si/sau transfectiei.
Datorita cercetarilor in tehnologia ADN-ului recombinat, au fost elaborate metode de transfer de gene in celulele procariote, care pot sintetiza multe proteine utile. Astfel, a devenit posibila producerea si chiar comercializarea pe scara larga a unor hormoni (insulina, somatostatina, somatotropina), a interferonului, a preparatelor de diagnosticare etc.
PLASMIDELE
Plasmida este o macromolecula de ADN prezenta in unele bacterii si mai rar in celule eucariote si care se poate replica autonom de cromozomul 'gazdei', dar folosind aparatul replicativ al celulei in care se gaseste. In general plasmidele sunt formate din ADN dublu catenar si au forma circulara. Intr-o singura celula se pot afla de la una pana la cateva sute sau chiar mii de copii ale aceleiasi plasmide.
Cand o celula bacteriana se divide, plasmidele care exista doar in cateva exemplare in interiorul ei risca sa se piarda dintr-unul din cele doua celule-fiice. De aceea, astfel de plasmide au mecanisme prin care pot sa plaseze copii ale lor in ambele celule care rezulta in urma diviziunii. Un altfel de mecanism folosit de plasmide pentru a
supravietui este
producerea unei substante daunatoare pentru celula gazda
care supravietuieste o perioada mare de timp, si a unui
antidote care dureaza mai putin. Astfel, celulele-fiice care
mostenesc plasmida continua sa primeasca antidotul si
supravietuiesc, iar cele carora plasmida le lipseste nu au cum
sa sintetizeze antidotul si mor.
Totusi, plasmidele pot disparea treptat din celulele bacteriene: li
se poate reduce numarul daca nu mai sunt necesare pentru celula
(de exemplu, daca ele confera rezistenta la un antibiotic
care nu mai exista in mediul de viata al celulei), sau pot fi
expulzate spontan in mediu, din diverse cauze.
APLICATIILE PLASMIDELOR.
Plasmidele sunt folosite pentru a multiplica diferite gene utile in diverse domenii. Gena care urmeaza a fi multiplicata este introdusa in plasmide contin deja gene pentru rezistenta la un antibiotic. Plasmidele sunt inserate la randul lor in bacterii, care sunt expuse acelui antibiotic pentru a filtra doar bacteriile in care plasmidele au fost introduce cu succes. Celulele modificate sunt cultivate pentru a produce substantele codate de gena introdusa in ele. Printre substantele care sunt obtinute in acest fel se numara insulina. Chiar unele antibiotice pot fi sintetizate cu ajutorul bacteriilor.
ADENOVIRUSURI
Ce este adenovirusul ?
Grup de virusuri care produc adenoviroze.
ADENOVIRUSURILE IN TERAPIA GENICA.
Toate virusurile ataca celulele-gazda si isi introduc materialul genetic in aceste celule, in urma ciclului lor de replicare. Acest material genetic contine informatia fundamentala a modului de producere a copiilor acestor virusuri, obligand astfel celula-tinta sa sintetizeze proteinele necesare metabolismului viral. Celula-gazda va utiliza aceasta informatie si va produce numeroase copii ale virusului care vor infecta noi celule. Anumite tipuri de virusuri isi insereaza propriu-zis genele in genomul gazda. Datorita acestor proprietati, medicii si biologii au realizat faptul ca virusurile pot fi utilizate ca "vehicule" care transporta genele "bune" in interiorul celulelor umane. In primul rand, un cercetator ar trebui sa inlature genele virale patogene, iar apoi sa le inlocuiasca cu gene care codifica o proteina ce determina un efect dorit (terapeutic), de exemplu producerea de insulina in cazul diabeticilor. Acest procedeu trebuie realizat astfel incat genele care ii permit virusului sa se insereze in genomul-gazda sa ramana intacte. Acest lucru necesita un efort semnificativ in cercetarea si intelegerea genelor virale, pentru a cunoaste exact functionarea fiecareia din ele. De aceea, exista numeroase probleme care impiedica o mai larga utilizare a vectorilor virali in terapia genica. Celule-tinta umane pot fi cele hepatice sau pulmonare, ce pot fi infectate cu un vector viral. Vectorul elibereaza la nivelul celulelor-tinta propriul materialul genetic, care contine genele terapeutice umane. Se vor sintetiza astfel proteine functionale ca produsi ai genelor terapeutice, care vor readuce celulele-tinta intr-o stare fiziologica.
Avantajele utilizarii vectorilor virali sunt:
- capacitatea nativa a virusurilor de a se orienta si de a patrunde in celulele- tinta;
- posibilitatea manipularii prin inginerie genetica pentru cresterea selectivitatii in raport cu celulele-tinta;
Dezavantajele sunt:
- riscul patogen (dar virusurile pot fi manipulate prin inginerie genetica, astfel incat sa se anuleze capacitatea de replicare endocelulara si, implicit, efectul patogen);
- un virus nu poate transporta decat o cantitate limitata de material genetic;
- sunt imunogene si reciproc;
- daca pacientul este imun la un anume virus, pacientul nu va raspunde la tentativa terapeutica, daca se utilizeaza vectorul viral respectiv.
Liposomii sunt vezicule artificiale alcatuite din molecule fosfolipidice amfipatice aranjate intr-un strat bimolecular.Pana in prezent au fost elaborate cel putin opt tehici pentru obtinerea lor.
a.Tehica de preparare a liposomilor
Unul dintre aceste procedee implica dispersia solutiei apoase, ce trebuie incapsulata in liposome, intr-un solvent organic nemiscibil(eter-cloroform),care contine fosfolipide amfipatice dizolvate. Dupa ultrasonare, se formeaza un numar mare de picaturi mici, prin acoperire cu un monostrat fosfolipidic a solutiei apoase ce trebuie incapsulata. Prin evaporare la presiune redusa ,solventul organic este indepartat,iar concentratia micelelor inversate creste pana se formeaza un gel. In aceasta faza continutul apos este eliberat datorita destabilizarii micelelor inversate, iar monosraturile fosfolipidice invecinate "invelesc" unele micelle inversate formand liposomi. Prin aceasta tehnica se produc liposome cu diametreul cuprins intre 0,1-1 μm.
b.Utilizarea liposomilor ca sisteme de vehiculare
Aceste structuri au capacitatea de a ingloba molecule de AND si de a le introduce in celulele procariote lipsite de perete celular (Mycoplasma), sau convertire la protoplasti, sau in celulele eucariote (cellule animale). Au fost folositi pentru transferul unei plasmide neconjugative la bacterii si celule vegetale si chiar pentru transportul unor organite la eucariote.
ETIOPATOGENIA DIABETULUI ZAHARAT TIP 1
T1DM( Type 1 Diabetes Mellitus) este o afectiune cronica frecventa cu etiopatogenie autoimuna.El apare in urma distrugerii printr-un proces autoimun mediat de limfocitele T a celulelor β pancreatice secretante de insulina.Distrugerea este progresiva, afectand in final intreaga populatie β pancreatica si totodata selectiva deoarece celulele α (secretoare de glucagon) si δ(secretoare de somatostatin) isi mentin functia secretorie.Procesul autoimun apare la subiecti cu predispozitie genetica si este initiat de triggeri din mediul inconjurator. Riscul de aparitie a T1DM pe parcursul intregiii vieti este de 0,4% in populatia generala dar de 6% la rudele de gradul 1 ale pacientilor cu diabet insulinodependent.Riscul de 15 ori mai mare la rudele de gradul 1 demonstreaza puternica agregare intrafamiliala a cazurilor cu T1DM si sustine importanta factorilor genetici.
FACTORI GENETICI
Din punct de vedere genetic, T1DM este o afectiune complexa, poligenica, cu multiple alele predispozante si protectoare care interactioneaza intre ele.Genele de susceptibilitate genetica sunt localizate in doua regiuni cromozomiale si anume in regiunea HLA(Human Leucocyte Antigen) de pe bratul scurt al cromozomului 6 si in regiunea genei insulinei(secventiata de Bell in 1980) de pe bratul scurt al cromozomului 11.Mentionam ca regiunea HLA este impartita in trei clase(I, II, III) in cadrul carora se gasesc produsi codificati pe suprafata tuturor celulelor nucleate (pentru clasa I) si pe suprafata monocitelor, macrofagelor, limfocitelor T activate etc.( pentru clasa II).Rolul lor este de a prezenta antigenele( self sau straine) catre limfocitele T citotoxice sau Helper , avand astfel un rol central in raspunsul imun.
Cele mai cunoscute "gene diabetogene" apartin sistemului HLA si intereseaza faptul ca acestea pot fi intalnite la multe persoane care nu vor face niciodata boala iar pe de alta parte multe din persoanele nesusceptibile genetic vor dezvolta in viitor T1DM.Modul in care actioneaza diferitele alele HLA cu potential diabetogen se explica printr-o "reactie imuna exagerata" fata de unele antigene, de natura proteica si de origine endogena (self) sau exogena (nonself).De asemenea intre ereditatea diabetica si markerri genetici* de susceptibilitate pt diabet exista o diferenta mare.
Aparitia autoimunitatii anti β- celulare este favorizata de transcrierea scazuta a genei insulinei in timpul dezvoltarii intrauterine, ceea ce duce la o exprimare scazuta a "proinsulinei" in timus in acea perioada, astfel incat timocitele aflate atunci in perioada de selectie/maturare nu "invata" sa recunoasca ca self aceasta molecula.
Gena insulinei are un numar relativ redus de alele, dintre care cele mai cunoscute sunt: insulina Chicago, insulina Los Angeles, insulina Wakazama, Ins HIS10ASP, Ins ARG65Leu, Ins ARG65PRO, Ins ARG65HIS, Ins HIS10ASP. Variantele genei insulinei se asociaza mai ales cu toleranta alterata la glucoza si diabet insulinoindependent. Data fiind frecventa redusa cu care sunt intalnite variantele insulinei, contributia lor la patologia umana nu este semnificativa.
FACTORI VIRALI- sunt incriminati:
- virusul rubeolei, infectiile virale sezoniere;
- virusul Coxsackie B4;
- citomegalovirusul.
FACTORI AUTOIMUNI:
- diabetul insulino-dependent se asociaza cu alte maladii autoimune puse in evidenta de infiltratia limfocitara si fibroza anumitor insule Langerhans;
- intervine atat imunitatea umorala, cat si cea mediata celular;
- rareori sunt prezenti anticorpi circulanti antiinsulari (sub 10%).
FACTORI INFLAMATORI: este demonstrat rolul interleukinelor 1 in inhibarea secretiei de insulina.
Ca si animal de experienta soarecele are multiple avantaje, in special in studiul imunologiei. Exista rase de soareci bine caracterizate imunologic precum si o multitudine de posibilitati de manipulare genetica (soareci transgenici si knockout). De asemenea, majoritatea reactivilor, tehnicilor si metodelor de cercetare biologica si imunologica sunt descrise si utilizate pe scara larga la soarece. Nu trebuie uitat si faptul ca soarecele este un animal ieftin, rezistent si usor de ingrijit.
Material si metoda
Animale
Au fost folsiti soareci masculi din rasa C57BL6 (linie pura) si soareci masculi knockout diabetici C57BL/k3, iar ingrijirea animalelor in laborator s-a facut respectand principiile si procedeele enuntate in "NIH Guide and Use of Laboratory Animals".
Designul experimentului
Am avut la baza lucrarii modelul experimental al
doctorului Chan si colab. de la "Baylor College of Medicine",
Au fost luate in studiu un numar 100 de animale receptoare care au fost impartite in 2 loturi (50 in fiecare lot) in functie de tipul de vector pe care il folosim in livrarea ADN-ului terapeutic. Astfel, la primul lot vectorul va fi adenovirusul "atenuat", iar la al doilea lot vectorul prin care vom livra AND-ul recombinant va fi non-viral→liposomul.
Tehnica
De la soarecii sanatosi am extras ADN-ul si prin metoda PCR-ului:
1. am fragmentat genomul organismului,cu ajutorul enzimelor de restrictie;
2. am purificat fragmentele obtinute prin electroforeza in gel de agaroza;
3. am identificat fragmentul ce continea gena dorita
A.La primul lot de soareci vectorul folosit de noi a fost un adenovirus atenuat, a carui gene virulente au fost inhibate. ADN-ul extras cu gena de inters am introdus-o in adenovirus folosind metoda experimentala a doctorului Chan si colab.
Adenovirusul ajuns in contact cu membrane celulara a celulei-tinta isi injecteaza continutul in interiorul celulei. ADN-ul terapeutic patrus ajunge in nucleu,dar nu va fi incorporate in ADN-ul celulei-tinta(hepatocitul). Molecula de ADN este libera in nucleul celulei-gazda, iar informatia continuta in aceasta molecula "suplimentara" de ADN este transcrisa la fel ca orice alta gena. Singura diferenta este ca aceasta "extra-gena" nu este replicata in momentul in care celula sufera o diviziune replicativa, deci, descendentii celulei nu vor fi purtatori ai informatiei genetice virale.
B.Al doilea lot de soareci - vectorul folosit a fost liposomul
Astfel , urmatorul pas dupa extragerea fragmentului de ADN cu gena dorita a fost insertia acestuia intr-o plasmida clivata cu aceeasi enzima de restrictie. Am utilizat endonucleaze de restrictie de tipul II pentru obtinerea de extremitati monocatenare coezive complementare la AND plasmidial si la AND strain, care au fost ulterior amestecate si legate covalent cu ajutorul ADN-ligazei. Pentru ca atat AND-ul plasmidic cat si molecula ce a fost incorporate au fost clivate cu aceeasi enzima de restrictie, fragmentele respective au prezentat extremitati adezive complementare si s-au hibridat indiferent de provenienta lor.(imagine 4.30 pag 216).
Am introdus plasmidele hibride in sferele lipidice artificiale, creand un pachet la care am adaugat si un anticorp care va ajuta liposomul sa treaca neobservat,fara a declanda reactii imune in organism si pentru a determina celula-tinta sa primeasca AND-ul terapeutic in citoplasma. Cand o celula-gazda se divide, plasmidele care exista doar in cateva exemplare in interiorul ei risca sa se piarda dintr-unul din cele doua celule-fiice. De aceea, astfel de plasmide au mecanisme prin care pot sa plaseze copii ale lor in ambele celule care rezulta in urma diviziunii. Deci,descendentii hepatocitelor modificate vor contine si ei plasmidul hibrid.
Exprimarea genei straine in celula-receptoare este esentiala,astfel daca sunt depasite barierele legate de traducerea informatiei genetice va avea loc sinteza proteinei dorite (insulina).
La ambele loturi injectarea vectorului s-a facut in ramura stanga a venei porte tributara lobului stang a ficatului. Acest procedeu nu a necesitat o interventie chirurgicala pentru ca am pus in evidenta vasul in care am injecta vectorul cu ajutorul unei substante de contrast pe care am administrat-o intr-o vena periferica. In cadrul examinarii venei porte am ales SonoVue deoarece creste calitatea imaginii Doppler privind fluxul sanguin si durata semnalului util din punct de vedere clinic. Odata evidentiata a fost mult mai usoara injectarea solutiei de ser fiziologic cu vectorul.
DE CE s-a facut injectatarea doar in ramul stang al venei porte?
In cazul unui esec al experimentului am dorit ca functiile lobului stang sa fie compensate de restului ficatului.
Pentru a observa daca gena insulinei a fost exprimata in hepatocit, am indus un nivel crescut al glicemiei prin incarcare cu glucoza si am urmarit daca are loc reglarea glicemiei in primele doua ore de la administrare la cele doua loturi de soareci. Pentru a mima cat mai bine celulele β-pancreatice producatoare de insulina am administrat si un factor specific lor NeuroD in combinatie cu betacelulina, un factor de crestere.
Rezultate
In cele doua loturi s-a observat o reglare a glicemiei,deci transferul de AND terapeutic a fost reusit, dar ca si in cazul experimentului doctorului Chan si colaboratorilor sai de la "Baylor Collage of Medicine" in primul lot de soareci unde am folosit ca vector adenovirusul atenuat am observat "vindecarea" diabetului pentru o perioada de patru luni.Ulterior, fiind necesara reinjectarea de AND terapeutic.
In cel de-al doilea lot de soareci unde s-au injectat liposomii cu plasmidele intregate s-a reusit o "vindecare" ce depaseste patru luni.
Concluzia
Comparand rezultatele obtinute la cele doua loturi de soareci am ajuns la concluzia ca cea mai buna metoda de tratare a diabetului tip I, utilizand terapia genica este injectarea de liposomilor cu plasmide integrate in ramura stanga a venei porte.
Bibliografie:
