Chemiluminescenta. Definitii si notiuni de baza.

Chemiluminescenta (CL) este emisia de radiatie electromagnetica (luminiscenta) fara emisie de caldura ca rezultat al unei reactii chimice dintre un analit A si un reactiv R, cu formarea unui intermediar excitat care se poate scrie:

[A] + [R] → [Intermediar*] → [Produsi] + radiatie

Revenirea compusului Intermediar* din starea excitata* pe un nivel energetic mai coborat este responsabila de emisia de radiatie. Desi raditia poate fi eliberata, in principiu, in domeniul UV, VIS sau IR, emisia de radiaitie vizibila este cea mai obisnuita si utila.

Specificarea ambigua "produsi" din reactia de mai sus este adesea necesara datorita naturii si complexitatii reactiei. Pentru chimistul analist, in majoritatea cazurilor, ambiguitatea legata de adevaratii produsi de reactie nu este importanta, deoarece el este interesat de sensibilitatea instrumentului (adica limitele de detectie pentru analitii de interes), de selectivitate (adica raspunsul dat de un analit este comparat cu cel al unui compus interferent) si domeniul liniar al raspunsului.

In teorie, pentru fiecare molecula de reactant este emis un foton de radiatie, sau numarul lui Avogadro de fotoni per mol. In practica, reactiile ne-enzimatice nu au eficienta cuantica, Q_C, mai mare de 1%.

In general o reactie de CL poate decurge prin doua mecanisme si anume:

□ printr-o reactie directa dintre un substrat (S) care este precursorul de chemiluminiscenta si un oxidant (Ox), in prezenta sau absenta unui catalizator (C) care poate fi un ion metalic sau o enzima, cu formarea unui produs sau intermediar (P). O parte din acest compus P se afla intr-o stare excitata (P*) care ulterior revine in starea fundamentala prin emisie de fotoni (hν).

■ printr-o reactie indirecta bazata pe transferul energiei de la specia excitata (P*) la un fluorofor (chemiluminiscenta sensibilizata sau chemiluminiscenta cu transfer de energie) care este astfel excitat si prin dezexcitare emite fotoni.

Reprezentarea schematica a celor doua mecanisme de baza de producere a reactiilor de CL

Cerinte pentru emisia de chemiluminiscenta.

Pentru ca o reactie chimica sa produca lumina ea trebuie sa indeplineasca urmatoarele conditii:

1.     Reactia trebuie sa fie exoterma pentru a produce energie suficienta pentru a forma stari excitate. Aceasta conditie este satisfacuta de reactii redox ce implica oxigen sau apa oxigenata sau oxidanti cu potential similar. Deoarece majoritatea reactiilor de chemiluminiscenta produc fotoni in domeniul vizibil formarea starii electronice excitate si generarea chemiluminiscentei in acest domeniu spectral necesita aprox 40-70 kcal. mol^-1.

2.     Calea de reactie trebuie sa fie favorabila formarii unei stari electronice excitate, de ex. reactia nu va fi chemiluminiscenta daca energia de reactie se pierde sub forma de caldura

3.     Emisia de fotoni trebuie sa fie o cale favorabila de dezexcitare a produsului excitat comparativ cu alte procese neradiative competitive de dezexcitare (izomerizare, transfer intramolecular de energie, reactii chimice cu alte specii, disociere moleculaza, etc.) care pot aparea in proportii mici.

Factori ce influenteaza emisia de chemiluminiscenta

Deoarece intensitatea de chemiluminiscenta depinde de numerosi parametrii masurarile de chemiluminiscenta sunt influentate de diferiti factori experimentali ca de ex.:

1.     Structura chimica a precursorului de CL

2.     Natura si concentratia altor substraturi ce influenteaza calea de CL si ar putea favoriza alte procese neradiative

3.     Catalizatorul

4.     Temperatura

5.     pH-ul si taria ionica

6.     Hidrofobicitatea solventului si compozitia solutiei (de ex. randamentul de CL a luminolului in dimetilsulfoxid este de 5 ori mai mare decat in apa iar radiatia emisa are lungime de unda diferita, in DMSO 425 nm (albastru-violet) si in apa 480-500 nm (albastru-verde)).

7.     Prezenta acceptorilor de transfer de energie.

Instrumentatia

Faptul ca un proces de chemiluminiscenta este propria sursa de radiatie face ca metodele si instrumentele de analiza sa fie foarte simple. Prin urmare luminometrele :

• Nu necesita sursa de excitare (cum este in cazul fluorescentei si fosforescentei)
• Nu necesita monocromator si adesea nici chiar un filtru
• Necesita doar:

-o celula de reactie (tub de analiza, celua in flux, microplaca) intr-o carcasa etans pentru radiatie

-un sistem pentru introducerea si amestecarea probei si  a reactivului;

- un detector de radiatie cum ar fi tubul fotomultiplicator, fotodiode sau sau in cazul cel mai simplu un film fotografic sau de raze X sau chiar detector visual;

-un sistem de achizitie si procesare a semnalelor.

Reprezentarea schematica a unui chemiluminometru D=detector; A+P=sistem de achizitie si prelucrare a semnalelor; S_a = semnal analitic; I_a = informatie analitica

Semnalul analitic in tehnicile CL

In tehnicile CL dupa amestecarea reactivilor cu proba incepe reactia de CL si se produce radiatie, intensitatea acesteia scazand pe masura ce se consuma reactivii ceea ce implica un caracter tranzitoriu al emisiei de CL, a carei durata depinde de reactia specifica si care poate fi de la un flash scurt la o radiere lunga. Acest lucru este important pentru alegerea sistemului optim de reactivi.

In functie de situatie, semnalul analitic poate fi luat ca intensitatea maxima de CL (inaltimea picului), semnalul dupa un timp fix de la punctul de amestecare, integrarea semnalului pe o anumita perioada, sau integrarea intregului pic (fig. ). Toate acestea sunt corelate cu concentratia analitului.

Variatia intensitatii de CL cu timpul (a) si curba de etalonare (b) pentru masurari de CL.

Reactii de chemiluminiscenta

Reactiile de chemiluminiscenta pot fi grupate in trei categorii:

1. Reactiile chimice care utilizeaza compusi sintetici si de obicei implica specii puternic oxidante, ca de exemplu un peroxid, se numesc reactii de chemiluminiscenta.
2. Reactiile emitatoare de lumina care rezulta din organisme vii, cum este licuriciul sau meduza, se numesc reactii de bioluminiscenta.
3. Reactiile emitatoare de lumina care au loc sub influenta curentului electric se numesc reactii de electrochemiluminiscenta.

Reactiile de chemiluminiscenta si bioluminiscenta implica de obicei scindarea sau fragmentarea legaturii O-O dintr-un compus peroxidic organic. Peroxizii, in special peroxizii ciclici, sunt predominanti in reactiile emitatoare de lumina deoarece legatura peroxidica slaba este scindata usor iar reorganizarea moleculara rezultata elibereaza o cantitate mare de energie.

1. Chemiluminiscenta peroxioxalatului [bis(2,4,6-triclorofenil)oxalatului (TCPO)]

Una dintre secventele de reactie propuse pentru reactia peroxioxalatilor, pentru care bis(2,4,6-triclorofenil) oxalatul esterul difenilic al acidului oxalic, Cyalume^®, sau TCPO) este exemplul cel mai proeminent, implica reactia dintre TCPO (combustibil) si H₂O₂ (oxidant) pentru a produce un intermediar, in acest exemplu 1,2 -dioxetandiona dar au fost propusi si altii, ca hidroperoxioxalat

bis(2,4,6-triclorofenil) oxalat (TCPO) Apa oxigenata  2,4,6-triclorfenol 1,2-dioxietandiona

(combustibil)                   (oxidant) (intermediar)

Intermediarul, aici 1,2-dioxetandiona, nu emite deloc lumina dar in schimb ea reactioneaza cu un alt compus, adesea un compus viabil drept colorant fluorescent (fluorofor), de ex. 9,10-difenilantracen (DPA), cu formarea produsului excitat care emite rapid lumina. Spectrul de emisie al DPA ca fluorofor prezinta maximul de emisie la 425 nm similar cu emisia de fluorescenta normala a DPA.

a)                                             b)

Reactia dioxetandionei cu 9, 10-difenilantracen (a) si spectrul de emisie al difenilantracenului ca fluorofor de chemiluminiscenta (b

Pentru a avea aplicabilitate practica reactiile oxalatilor, de ex, in HPLC, necesita un sistem mixt de solventi (tampon/solvent organic) pentru a asigura solubilitatea reactivilor, un pH optimizat, si permite compatibilitatea cu analitii.

In sistemul TCPO descris mai sus viteza de descompunere, constanta de crestere, intensitatea maxima a luminii si eficienta cuantica depind de concentratia apei oxigenate.

Procesul de transferare a energiei reactiei initiale, reactia chimica dintre apa oxigenata si TCPO, spre emisia de lumina de la fluoroforul in stare excitata (fluorofor*) poate fi urmarit pe tot parcursul procesului, prin pierderile in fiecare etapa a procesului: oxidarea initiala pentru a produce intermediarul, reactia intermediarului cu un fluorofor si reactia fluoroforului excitat pentru a produce lumina.

Oxidarea initiala poate produce:

• intermediarul de energie inalta sau
• TCPO poate fi hidrolizat sau
• poate avea loc o oxidare care nu duce la produsi chemiluminiscenti

Intermediarul cu energie ridicata:

• poate reactiona pentru a excita fluoroforul sau

• poate reactiona cu un stingator de fluorescenta care se oxideaza mai usor ca fluoroforul

• poate reactiona cu fluoroforul fara ca sa genereze fluorofor excitat

• se poate descompune sau poate fi oxidat in continuare de catre H₂O₂ reziduala  

In cele din urma, fluoroforul excitat poate:

J pierde energie prin emisia de lumina sau

L fi dezexcitat prin producerea de caldura in locul luminii.

Difeniloxalatul daca este utilizat intr-un stick luminescent (lightstick sau glowstick), emite radiatie prin chemiluminiscenta unui colorant fluorescent (numit sensibilizator) activat de Cyalume^® ce reactioneaza cu apa oxigenata in cea mai eficienta reactie ne-enzimatica cunoscuta.

Cyalume^® + H₂O₂ + colorant → fenol + 2CO₂ + colorant*

Cand colorantul fluorescent activat revine pe un nivel energetic mai coborat se emite radiatie. Culoarea depinde de colorant.

2.  Chemiluminiscenta luminolului

Luminolul (5-amino-2,3-dihidro-1,4-ftalazindiona), un alt reactiv chemiluminiscent larg utilizat este considerat drept "combustibil" in reactia care genereaza 3-aminoftalat (3-APA) ca specie emitatoare (fig. a). Spectrul de emisie 3-APA in reactia chemiluminiscenta a luminolului este prezentat in figura b (I_e = intensitatea radiaitiei de chemiluminiscenta).

a)                                             b)

Reactia de chemiluminiscenta a luminolului (a) si spectrul de emisie al 3-APA (b).

Desi oxidantul cel mai utilizat este apa oxigenata similar cu chemiluminiscenta peroxioxalatului au fost utilizati si alti oxidanti ca 

perborat,

permanganat,

hipochlorit si

iod.

Emisiei radiatiei de chemiluminiscenta a 3-APA rezultat in reactia de oxidare a luminolului cu apa oxigenata este aproape instantanee si atingeun maxim in cateva secunde.

Dupa cum profilul de timp al emisiei luminolului (I_e = intensitatea radiatiei emise exprimata in unitati arbitrare) intensitatea luminii scade la aproximativ 50% din valoarea maxima dupa aproximativ 8 s iar atat intensitatea initiala cat si viteza de scadere a acesteia in acest tip de sistem au fost dependente de continutul de Cu(II).

Profilul de timp al emisiei luminolului (I_e = intensitatea radiatiei emise exprimata in unitati arbitrare)

Analitii derivatizati cu luminol permit determinarea compusilor care normal nu ar prezenta chemiluminiscenta in acest sistem si probabil au emitatori usor diferiti

Multi cationi metalici (cel mai sensibil este cobaltul(II)) catalizeaza reactia dintre luminol, H₂O₂, si OH^- in solutie apoasa pentru a mari emisia de lumina sau cel putin de a mari viteza oxidarii pentru a produce emitatorul (un complex metal peroxid) si prin urmare inceputul/intensitatea producerii de lumina. Prin urmare aceasta poate fi baza unor determinari analitice semnificativ diferite. De ex, sistemul poate fi utilizat la determinarea:

• luminolului insusi prin mentinerea constanta a celorlaltor variabile
• derivatilor asemanatori luminolului
• apei oxigenate sau la urmarirea desfasurarii reactiilor care produc H₂O₂
• concentratiilor de cationi metalici
• analitilor care afecteaza concentratia catalizatorilor metalici.

Aceasta ultima aplicatie este o caracteristica importanta a acestui sistem deoarece multi compusi de ex. amino acizii, fructoza, glicerolul, tiolii, si albumina serica formeaza complecsi cu cationi metalici si astfel pot fi determinati utilizand chemiluminiscenta luminolului.

Reactia de chemiluminiscenta a luminolului a fost studiata folosind diferite peroxidaze drept catalizator. HRP este un catalizator slab al reactiei iar eficienta sa poate fi considerabil imbunatatita prin adaugarea la reactie a unor compusi, cunoscuti sub denumirea de "amplificatori", care cresc emisia de radiatie cu cateva ordine de marime. Fenomenul se numeste "chemiluminiscenta amplificata" (ECL).

Numerosi compusi fenolici, unele amine aromatice, anumiti heterociclii, in particular benzotiazoli, si acizi acrilboronici functioneaza ca amplificatori in reactiile de oxidare mediate de peroxidaze. Compusii din ultima grupa actioneaza probabil prin intermediul conversiei la fenol prin reactia in situ cu peroxidul de hidrogen.

6-hidroxibenzotiazol p-iodofenol (p-PI) dehidroluciferina

p-fenilfenol (p-PP)                                  1,6-dibrom-2-naftol 4-benziloxianilina

Molecule capabile de a amplifica emisia de radiatie produsa in reactia de oxidare a luminolului catalizata de HRP

Eficacitatea unui amplificator pare a fi bazata, in principiu, pe potentialul sau de oxidare in conditiile de reactie si relatia sa cu potentialul de oxidare al substratului detectabil

In prezenta amplificatorilor, emisia de radiatie scade lent (dureaza cateva minute) iar intensitatea sa poate fi de pana la 1000 ori mai mare decat in reactia neamplificata

Amplificatorii actioneaza sinergetic in reactia dintre luminol si peroxid catalizata de peroxidaze. Gradul de amplificare depinde de:

identitatea amplificatorului; de ex. p-indofenolul duce la o amplificare de pana la 2500 ori a emisiei de radiatie, comparativ cu reactia neamplificata

pH; amplificare semnificativa are loc intre pH 7 si 9,5 , valoarea maxima atingandu-se in jur de pH 8,6;

concentratia amplificatorului; amplificatorii prezinta o concentratie optima pentru amplificare iar adaos mai mare de amplificator la reactia peroxidaza-luminol-peroxid scade gradul de amplificare.

Spectrele de emisie ale reactiilor amplificate si neamplificate sunt foarte similare sugerand ca amplificatorii nu actioneaza ca emitatori mai eficienti dar isi exercita actiunea mai rapid in reactia complexa dintre peroxidaza, oxidant si luminol

3. Alte reactii in faza lichida

Solutii continand ioni de mangan (VII, IV, III) prezinta chmiluminiscenta (690 nm) cand sunt redusi la Mn(II) cu borohidrura de sodiu la pH mic

Una dintre cele mai eficiente substante chemiluminiscente, lucigenina (azotat de bis-N-metilacridina) prezinta o emisie verde foarte stralucitoare care trece in emisie albastru-verzuie si in final albastra cand este oxidata in mediu alcalin. In conditii optime durata emisiei poate fi de pana la cateva minute.

In timp ce luminolul reactioneaza cu o varietate de specii reactive ale oxigenului (H₂O₂, O₂^-, OH) chemiluminiscenta lucigeninei este mai specifica pentru anionul superoxid si astfel este larg utilizata ca metoda de analiza a producerii enzimatice de superoxid in multe sisteme biologice.

S-a aratat ca alti derivati de acridina produc emisie de chemiluminiscenta la oxidarea cu apa oxigenata in mediu apos alcalin. Principalul produs de reactie, N-metilacridona, un intermediar activ, este de asemenea foarte cunoscut printre reactiile de chemiluminiscenta.

4. Reactii in faza gazoasa

Dezvoltarea metodelor de chemiluminiscenta pentru determinarea componentilor gazosi a pornit de la necesitatea determinarii poluantilor atmosferici.

Una dintre cele mai vechi reactii de chemiluminiscenta cunoscute este cea a fosforului elementar alb care se oxideaza in aer umed generand o incandesceta verde. Aceasta este de fapt o reactie in faza gazoasa a vaporilor de fosfor, deasupra solidului, cu oxigenul. Mecanismul acestei reactii nu a fost inca elucidat complet.

In flacari bogate in hidrogen, bioxidul de sulf si alti compusi ai sulfului prezinta emisie de chemiluminiscenta datorita sulfului elementar excitat produs:

SO₂ + 2H₂ → S + 2H₂O

S + S → S₂*

S₂* →S₂ + lumina (300-425 nm)

Prin aceasta metoda compusi ai sulfului au putut fi determinati la nivel de cateva ppm.

Urmatoarea secventa de reactie de chemiluminiscenta intre bioxidul de sulf si oxigen a fost propusa pentru analiza SO₂ la nivel de 0,001 ppm.

O + O + SO₂ → O₂ + SO₂*

SO₂* → SO₂ + lumina (280 nm)

Dezavantajul metodei consta in dificultatea gasirii unei surse stabile de atomi de oxigen.

Detectia monoxidului de azot cu instrumentele analitice comerciale utilizate pentru testarea calitatii aerului se bazeaza pe reactia in faza gazoasa in care ozonul (O₃) se combina cu NO pentru a forma bioxid de azot intr-o stare activata (notata cu *) care revine la o stare energetica inferioara prin emisia partiala de fotoni de radiatie electromagnetica cu un domeniu spectral larg, de la vizibil pana in IR (lungimile de unda sunt centrate in jur de 1200 nm).

NO + O₃ → NO₂* + O₂

NO₂* → NO₂ + lumina (600-2800 nm)

Cuvantul "partiala" arata ca exista doua cai prin care NO₂ din starea excitata se poate dezexcita: prin emisie de fotoni (chemiluminiscenta) sau prin pierderea de energie prin coliziuni cu alte particule. Deoarece numarul colizionilor din faza gazoasa este mai mic la presiuni mai mici pentru reducerea pierderilor de energie prin ciocnirea moleculelor, majoritatea reactiilor de chemiluminiscenta in stare gazoasa au loc la presiune mica (~1 torr) mentinuta cu ajutorul unei pompe de vid. Astfel numarul de dezactivari prin ciocniri scade si creste cantitatea de energie eliberata prin emisie de fotoni.

Un tub fotomultiplicator si alte componente electronice asociate numara fotonii al caror numar este proportional cu cantitatea de NO prezenta in aer. Pentru determinarea cantitatii de NO₂ dintr-o proba ce nu contine NO, inainte de a se aplica reactia de activare cu ozon NO₂ trebuie transformat in NO, prin trecerea probei printr-un convertor. Reactia cu ozon produce un numar de fotoni proportional cu NO care este proportional cu NO₂ inainte ca acesta sa fie transformat in NO. In cazul unei probe de aer mixte, continand atat NO cat si NO₂, reactia de mai sus da suma NO+ NO₂ daca proba este trecuta prin convertor. Daca proba mixta nu este trecuta prin convertor reactia cu ozon produce NO₂* activat doar intr-o cantitate proprotionala cu NO din proba. NO₂ din proba nu este activat de reactia cu ozon. Desi NO₂ neactivat este prezent cu NO₂* activat, doar specia activata emite fotoni al caror numar este proportional cu NO initial din proba. In final se scade NO din (NO + NO₂) pentru a obtine NO₂.

Aceasta reactie este folosita pentru determinarea de rutina fie a ozonului (utilizand exces de NO) sau a NO (folosind exces de O₃).

In chemiluminiscenta in faza gazoasa producerea luminii are loc aproape instantaneu; de aceea, majoritatea sistemelor analitice amesteca pur si simplu analitii si reactivul intr-o camera cu volum mic direct in fata tubului fotomultiplicator. Daca analitii sunt eluati dintr-o coloana a unui cromatograf de gaze atunci adesea capatul coloanei este prins direct in camera de reactie (fig. ).

Fig. Reprezentarea schematica a unui detector GC de chemiluminiscenta (TFM=tub fotomultiplicator)

Bioluminiscenta este un fenomen natural care are loc in adancimile acvatice unde unele specii produc lumina pentru a supravietui in mediul intunecat si ostil.

= generarea de lumina [(chemi)luminiscenta] de diverse culori de catre organisme vii (de ex. unele bacterii, ciuperci, licurici si multe animale marine), licuriciul american fiind cel mai studiat caz de bioluminiscenta. Luminiscenta este produsa de o reactie biochimica care este catalizata de o enzima.

Sunt necesari cel putin doi reactivi chimici : unul care produce lumina si se numeste generic « luciferina » si unul care conduce sau catalizeaza reactia si se numeste « luciferaza ». In reactie se produce oxiluciferina inactiva si lumina.

Luciferina + oxiluciferina + lumina (hν

In majoritatea cazurilor in sistem trebuie introdusa luciferina proaspata fie prin dieta fie prin sinteza interna.

Desi in mare sunt surprinzator de multe animale luminoase exista totusi doar cateva tipuri de baza de luciferine (emitatoare de lumina) (tabel ) care au fost gasite in diferitele specii.

Reactia licuriciului are cea mai mare eficienta cuantica cunoscuta pentru reactii de chemiluminiscenta, Q_C de 88%. ATP (adenozin tri-fosfat), sursa biologica de energie omniprezenta reactioneaza cu luciferina pentru a forma un complex intermediar care se combina cu oxigen pentru a produce un compus puternic chemiluminiscent.

Tabelul . Principalele tipuri de luciferine marine

Instrumentatie

Pot fi dezvoltate instrumente pentru a masura bioluminiscenta, alaturi de alte caracteristici ale oceanului cum ar fi temperatura, salinitatea, transmisia optica si fluorescenta stimulata.

Aceasta informatie poate fi utilizata pentru a crea mape bi- si tridimensionale de bioluminiscenta din ocean.

Caracteristici ale spectrometriei bazata pe chemiluminiscenta comparativ cu alte tehnici spectrometrice

1.     Chemiluminiscenta, ca si spectrometria de emisie atomica (AES) utilizeaza masurarile cantitative ale emisiei optice a speciilor chimice excitate pentru a determina concentratia analitului; oricum, spre deosebire de AES, chemiluminiscenta este de obicei emisia unor molecule energizate in locul unor atomi simpli excitati. Benzile de lumina determinate prin aceasta tehnica rezulta din emisii moleculare si prin urmare sunt mai largi si mai complexe decat cele care isi au originea in spectrele atomice. Mai mult, chemiluminiscenta poate avea loc fie in solutie sau in faza gazoasa, in timp ce AES este aproape strict un fenomen in faza gazoasa.

2.     Majoritatea probelor nu au semnal de fond, adica nu emit ele insele, astfel ca nu exista semnale interferente care sa limiteze sensibilitatea.

3.     Masurarea chemiluminiscentei nu este o masurare a unui raport asa cum este cazul fluorescentei sau a absorbtiei. In fluorescenta acest lucru poate duce la dificultati cu compusii care prezinta o deplasare Stokes mica. Fluorescenta ar putea fi greu de rezolvat de lungimea de unda de excitare iar in masurarile absorbtiometrice factorul ce limiteaza sensibilitatea este necesitatea de a masura o diferenta mica intre doua semnale relative mari.

In masurarile de chemiluminiscenta trebuie insa ca raspunsul spectral al sistemului de detectie sa fie cat mai aproape de spectrul CL pentru ca sensibilitatea determinarilor sa fie maxima.

4.     Spre deosebire de tehnicile bazate pe fotoluminiscenta in cele de CL nu este necesara o sursa externa de radiatie ceea ce ofera urmatoarele avantaje:

-instrumentatie simpla;

-absenta problemelor legate de instabilitatea sursei de radiaitie;                                                  

-absenta fenomenului de imprastiere a radiaitiei incidente pe detector

-reducerea interferentelor datorate proceselor  neselective de excitare.

Majoritatea tehnicilor de chemiluminiscenta implica doar cateva componente chimice pentru a genera cu adevarat lumina.

5.     Selectivitatea si liniaritatea depind in principal de reactie si de conditiile de reactie in timp ce la procesele de fotoluminiscenta absorbtia si/sau emisia de radiatie de catre alti compusi (produsi, intermediari, componente ai matricei) pot determina interferente si neliniaritate.

6.     In functie de natura analitului si a reactiei CL cresterea sau scaderea intensitatii CL depinde direct de concentratia analitului.

7.     Desi nu este asa de larg aplicabila ca spectroscopia bazata pe excitare, chemiluminometria este foarte sensibila si prezinta un domeniu liniar mare. Daca randamentul cuantic este mare se pot atinge limite de detectie in domeniul femtomolar (de ex. in solutie se poate detecta sub 1 fmol fluorofor daca se utilizeaza CL peroxioxalatilor si sub 0,1 fmol daca se foloseste luminol). Limitele de detectie pentru metodele de chemiluminiscenta pot fi de 10 pana la 1000 ori mai coborate decat pentru alte tehnici de luminiscenta. In general CL este de aproximativ 10⁵ ori mai sensibila ca tehnicile bazate pe absorbtie si de cel putin 10³ ori mai sensibila ca fluorimetria.

Limitarea principala a limitelor de detectie ce pot fi atinse prin chemiluminiscenta implica curentul rezidual (de fond) al detectorului (de ex. tubul fotomultiplicator) necesar pentru a detecta emisia de radiatie a analitului.

8.     Tehnica este versatila pentru determinarea unei varietati mari de compusi care pot fi implicati in reactii CL cu mar fi:

- substratul de CL sau precursorul CL care este responsabil de generarea starii excitate;

- reactivul (de obicei un oxidant) necesar reactiei de CL

- specii care influenteaza viteza reactiei CL (activatori, catalizatori -enzime sau ioni metalici, inhibitori - reducatori)

- fluorofori in CL sensibilizata

- specii ce pot fi derivatizate cu precursori de CL sau florofori

- specii care un participa direct la reactia de CL dar genereaza sau consuma, in alta reactie, un compus ce va fi implicat in reactia de CL

9. Reactiile CL pot fi cuplate ca mijloc de detectie in tehnicile cromatografice, imunoanaliza, electroforeza capilara, furnizand informatii calitative si cantitative despre o gama larga de specii