Determinarea spectrofotometrica a puritatii si concentratiei adn cromozomal izolat

Informatii » scoala » biologie

biologie botanica chimie cultura didactica diverse film fotografie fizica geografie gradinita informatica istorie matematica muzica psihic sport

DETERMINAREA SPECTROFOTOMETRICA A PURITATII SI CONCENTRATIEI ADN CROMOZOMAL IZOLAT

Inainte de a fi folosit in diverse manipulari moleculare, ADN-ul extras si purificat, este necesar sa se verifice puritatea si integritatea lui.

a.) Verificarea puritatii ADN

Se realizeaza de regula spectrofotometric tinandu-se cont de urmatoarele:

Moleculele ADN prezinta absorbanta maxima la lungimi de unda ce variaza intre 257 si 260nm; cel mai frecvent, ADN-ul de origine bacteriana prezinta peak-ul specific la λ=258nm;

Absorbanta maxima pentru proteinele ramase eventual in extract este la λ=280nm; pot exista si proteine care absorb radiatiile luminoase cu λ=260nm, dar contributia lor la absorbanta totala a unui extract ADN la λ=260nm este echivalenta cu cea a absorbantei la λ=300nm;

Unele polizaharide absorb radiatiile luminoase cu λ=230nm;

Absorbanta la 220nm este data de oligonucleotide ce reprezinta de obicei molecule de ADN fragmentat in mod artificial in timpul tehnicilor de extractie si purificare.

In functie de valorile A₂₆₀ si A₂₈₀ se poate stabili gradul de contaminare proteica, astfel:

Raportul A₂₆₀/A₂₈₀ optim este de 1,8 - 2,0;

Daca acest raport este mai mic de 1.7, atunci contaminarea proteica a extractului ADN este semnificativa

Raportul poate fi imbunatatit printr-un nou tratament cu amestec cloroform : alcool izoamilic, urmat de precipitare cu etanol 100% rece (-20°C); pentru a creste procentul de ADN precipitat, se recomanda adaugarea de NaCl pana la concentratia finala de 0,1M inainte de a se adauga etanol.

Gradul de contaminare cu ARN a extractului este indicat de valori mai mari de 2.0 ale raportului A₂₆₀/A₂₈₀. Se recomanda:

Tratament cu RNA-za A aplicat extractului de ADN, urmat de deproteinizare si reprecipitarea moleculelor de acizi nucleici.

Gradul de contaminare cu polizaharide se determina in functie de valoarea raportului A₂₆₀/A₂₃₀, care trebuie sa fie mai mare de 2. Daca obtinem valori mai mici de 2, acest lucru este o dovada a prezentei polizaharidelor in extractul ADN. Polizaharidele pot fi indepartate prin precipitare cu etanol, precedata de tratamentul cu solutie NaCl in concentratie finala de 0.1M.

Se recomanda:

Folosirea unor cuve de cuart;

Determinarea intregului spectru de absorbtie al probei, in domeniul λ = 200-350nm, pt a putea evitentia eventualii contaminanti din extract ce prezinta peak-uri la alte lungimi de unda decat cele mentionate.

b) Determinarea concentratiei ADN

Cea mai simpla metoda se bazeaza pe citirea absorbantei la λ=260nm. Astfel, se pot folosi urmatoarele formule:

A₂₆₀=1 corespunde la 50mg ADN dc / ml

A₂₆₀=1 corespunde la 33mg ADN mc / ml

A₂₆₀=1 corespunde la 40mg ARN mc /ml

A ₂₆₀=1corespunde la 20mg oligonucleotide / ml

Se recomanda ca:

Determinarea concentratiei ADN pe baza A₂₆₀ sa fie corelata si cu aspectul ADN in gel electroforeza.

Atunci cand intregul volum al probei este foarte mic astfel incat nu permite citirea spectrofotometrica, estimarea concentratiei ADN, sa se realizeze cu ajutorul electroforezei in gel de agaroza. In acest caz se incarca in gel un volum mic de proba, iar alaturat se incarca mai multe godeuri cu concentratii de ADN cunoscute. Concentratia probei este apoi apreciata in comparatie cu intensitatea spoturilor fluorescente emise de solutiile cunoscute (se coloreaza cu Bromura de etidiu). Metoda permite detectarea unor cantitati infime de ADN (1-5ng).

Alte conversii importante sunt date de urm`toarele formule:

1kb ADN dc (sare de sodiu) = 6.6x 10⁵ dal

1Kb ADN mc (sare de Na) = 3.3 x 10⁵dal.

1Kb ARN mc (sare de sodiu) = 3.4 x 10⁵ dal

Greutatea molecular` medie a unei nucleotide = 330dal

1mg de ADN de 1000bp = 1.52 pmol

1pmol de ADN de 1000bp = 0.66mg

Formule pentru conversiile molare ale ADN dc:

pmol x N x 660pg/pmol x 1mg/ 10⁶pg =mg

mg x 10⁶pg/1mg x pmol/660 x 1/N = pmol, unde N - reprezinta nr de nucleotide.

Pentru ADNmc se folosesc aceleasi formule, singura diferenta fiind inlocuirea valorii de 660 cu 330.

Documente similare

botanica

chimie

Upload!

Trimite cercetarea ta!
Trimite si tu un document!
NU trimiteti referate, proiecte sau alte forme de lucrari stiintifice, lucrari pentru examenele de evaluare pe parcursul anilor de studiu, precum si lucrari de finalizare a studiilor universitare de licenta, masterat si/sau de doctorat. Aceste documente nu vor fi publicate.