|
|
|
ABERATII CROMOZOMIALE ASOCIATE CU TULBURARI ALE DIFERENTIERII SEXUALE SI TEHNICA FISH
Tehnica FISH(Fluorescence in situ hybridization) e una din cele mai utilizate tehnici in diagnosticul citogenetic,permitand evidentierea anomaliilor cromozomiale,atat numerice cat si structurale,chiar si in nucleii interfazici.
FISH-ul metafazic: Principiul acestei metode este hibridizarea (legarea) prin complementaritate a unei sonde de ADN cu o anumita regiune a unui cromozom. Sonda de ADN este in prealabil marcata cu ajutorul unui fluorocrom, ceea ce o face vizibila la microscopul cu fluorescenta. Astfel, se stabileste prezenta sau absenta secventei de ADN de interes (corespunzatoare sondei), numarul de copii ale secventei respective si pozitia pe un anumit cromozom.
Exista mai multe tipuri de sonde, in functie de tipul de anomalie cromozomiala suspicionata:
2.Sondele centromerice au rol in identificarea unui anumit cromozomsi/sau detectarea anomaliilor numerice ale cromozomului respectiv.
3. Sondele telomerice permit diagnosticarea microdeletiilor sau altor rearanjamente criptice.
4. Sonde subtelomerice
5. Sondele specifice unui
cromozom permit "colorarea" intregului cromozom sau doar a unei regiuni. Prin
colorarea diferita a doi sau mai multi cromozomi se pot identifica mici
rearanjamente in care acestia sunt implicati.
In concluzie, FISH-ul metafazic aduce in plus
fata de cariotip sau de FISH-ul interfazic detalii despre anomaliile de
structura ale cromozomilor. Intrucat aceasta metoda presupune ca prima etapa de
lucru, obtinerea unor culturi celulare (limfocite din sange periferic sau
amniocite recoltate prin amniocenteza in saptamanile 15-17 de sarcina),
intervalul minim pentru diagnostic este de doua saptamani.
Am luat in studiu un lot de aproximativ 200 persoane de ambele sexe, avand o simptomatologie larga in materie de disfunctii sexuale, de la forme usoare pana la forme destul de grave care afectau capacitatea de reproducere.
1. Obtinerea de culturi de limfocite prin metoda standard, la care in scopul optimizarii culturilor am lucrat pe culturi pure, prin sapararea limfocitelor pe ficoll, si verificarea puritatii prin preparate microscopice
2. Aplicarea testului Barr pe frotiuri obtinute din singe periferic, colorate May-Grunwald-Giemsa
3. Aplicarea testului ELIZA pentru dozajul hormonal
4. Aplicarea tehnicii de bandare Giemsa, in vederea realizarii cariotipurilor.
5. Prelucrarea computerizata a imaginilor microscopice prin programul Image Pro si realizarea cariotipurilor.
6. Aplicarea tehnicii FISH pe preparatele selectate: lamele au fost pretratate cu RNA- aza 30- 60 minute la 37 grade Celsius, spalate su 2xSSC 5 minute cu agitare, tratate cu PBS/50mM MgCl2 5 minute si deshidratate intr-o serie de etanol 70%, 90%, 100% cate un minut fiecare.Sondele au suferit un tratament de prehibridare dupa cum urmeaza :mixul de hibridare(2 µl DNA marcat cu biotina+1µl Cot 1 DNA+ 7 µl MM2.1) a fost deneturat la
75 grade Celsius 5-7 minute urmat de o tratare la gheata de 3 -5 minute si o incubare la 37 grade Celsius intre 15 minute si 2 ore. Urmatorul pas a fost denaturarea metafazelor, care s-a realizat la 75 grade celsius timp de 2 minute pe o baie de apa, urmata de mai multa spalari cu 2xSSC rece si o deshidratare cu etanol rece 70%, 90%, 100% cate un minut fiecare
Pentru hibridizare se aplica 10 µl de mix pe lame, se acopera imediat si se lasa la 37 grade Celsius peste noapte. Dupa hibridizare urmeaza o serie de spalari, marirea semnalului cu avidina FITC si vizualizarea preparatelor.
BIBLIOGRAFIE:
2.Genetica- metode de laborator. P. Raicu, I. Anghel, Veronica Stoian, Doina Duma, Elena Taisescu, Elena Badea, Liliana Gregorian, Editura Academiei, 1983
3. Human genetics. Problems and Approaches.Third edition. F. Vogel, A.G.Motulsky Springer 1997
