Obtinerea peretelui celular si a altor produse de valorificare din biomasa de drojdie de bere reziduala

OBTINEREA PERETELUI CELULAR SI A ALTOR PRODUSE DE VALORIFICARE DIN BIOMASA DE DROJDIE DE BERE REZIDUALA

CUPRINS

I. STUDIU DOCUMENTAR PRIVIND OBTINEREA PERETELUI CELULAR si a ALTOR PRODUSE DE VALORIFICARE din BIOMASA DE DROJDIE DE BERE REZIDUALA

II. PARTEA  EXPERIMENTALA

1. Materiale, metode de analiza, aparatura

1.1  Drojdia de bere reziduala

1.2  Materiale

1.3  Aparatura utilizata in experimentari

1.4  Metode de analiza utilizate in experimentari

2. Tratamente pentru obtinerea peretelui celular din drojdia de bere reziduala

1.1  Drojdia de bere reziduala

In experimentari s-a utilizat biomasa de drojdie de bere Saccharomyces uvarum sau Saccharomyces carlsbergensis sub forma de suspensie dupa mai multe cicluri de fermentare ( drojdie reziduala de diferite generatii) provenind de la o fabrica de bere din Romania S.C " MARTENS" S.A din Galati.

1.2  Materiale

1.3  Aparatura utilizata in experimentari

Microscop - 3 tipuri , Centrifuga - 3 tipuri, Microscop electronic, Balanta analitica, Balanta electronica, Autoclava, Moara cu bile din inox, pH- metru, Spectrofotometru - 3 tipuri , Agitator incubator, Baie ultrasonica, Agitator magnetic, Reotest, Ultrafrizer, Termobalanta, Cuptor de calcinare, Instalatie de demineralizare si de distilare, Fibertec FOSS Tecator , Liofilizator, Etuva, Concentrator, Baie de apa , HPLC, ICPMS, Aparat pentru gheata, Vortex, Nisa .

1.4  Metode de analiza utilizate in experimentari

1.     Dozarea proteinelor solubile prin metoda Lowry

Principiul metodei

Proteinele formeaza combinatii complexe colorate in albastru violet cu ionul Cu²⁺ in mediu alcalin ( reactia biuretului). Complexul proteina- Cu²⁺reduce fosfomolibdatii si fosfowolframatii din reactivul Folin-Ciocalteu. La procesul de reducere mai contribuie si resturile de tirozina si triptofan prezente in proteine. Concentratia proteinelor din proba se determina fotocolorimetric.

Reactivi

Reactiv alcalin de cupru format din doua solutii:

A - solutie Na₂CO₃ 10% in solutie de hidroxid de sodiu 0,5N

B - solutie CuSO₄*5H₂O 0,5% in solutie de citrat de sodiu 1%

Inainte de intrebuintare se amesteca 10 parti solutie A cu 1 parte solutie B

( reactiv de lucru - preparat extemporaneu).

Reactiv Folin - Ciocalteu. Inainte de folosire reactivul se amesteca cu apa distilata in raport de 1:10 (reactiv de lucru).

Solutie standard de albumina serica de bovina 10 mg% preparata in apa distilata ( corespunde la 100 µg/ml sau 0,1 mg/ml)

Modul de lucru

Intr-o eprubeta se introduce 1 ml solutie de proba, 1 ml reactiv alcalin de cupru, se agita bine si se lasa la temperatura camerei. Dupa 10 minute se adauga 3 ml reactiv Folin-Ciocalteu (reactiv de lucru), se agita si se lasa la temperatura camerei 45 minute ( sau 10 minute intr-o baie termostatata la 50⁰C). In continuare eprubeta se raceste dupa care continutul ei se fotocolorimetreaza la 660 nm fata de apa distilata.

Construirea curbei etalon

In 11 eprubete numerotate de la 1 la 11, aranjate in ordine crescatoare, intr-un stativ, se adauga solutia standard de albumina serica de bovina in apa distilata corespunzand concentratiilor din tabelul 1.

Tabelul nr. 1

Se mai adauga in fiecare eprubeta cate 1 ml reactiv alcalin de cupru si dupa agitare se lasa in repaus 10 minute la temperatura camerei. Se introduc cate 3 ml reactiv Folin-Ciocalteu si dupa o buna agitare se lasa la temperatura camerei 45 minute ( sau 10 minute intr-o baie termostatata la 50⁰C). Eprubetele se racesc si se fotocolorimetreaza la 660nm fata de apa distilata. Cu datele obtinute se traseaza curba etalon luand pe abscisa concentratia de albumina din fiecare eprubeta (in µg/ml) iar pe ordonata densitatea optica corespunzatoare (D.O₆₆₀).

Calculul rezultatelor

Densitatea optica obtinuta pentru proba de analizat se interpoleaza pe curba etalon determinandu-se concentratia in µg/ml. In cazul cand densitatea optica a probei este mai mare decat densitatile optice de pe curba etalon proba se dilueaza cu apa distilata pentru a fi adusa in limitele concentratiilor necesare insa la calcule se tine seama de factorul de dilutie (Gioaba, 1986).

2 . Dozarea zaharurilor reducatoare prin reactia cu acidul 3,5-dinitrosalicilic

( DNS)

Principiul metodei

In mediu alcalin si la cald, grupa carbonilica a mono-, di si oligoglucidelor este oxidata la grupa carboxil de catre acidul 3,5-dinitrosalicilic. In reactie, o grupa nitro a acidului dinitrosalicilic se reduce la grupa aminica formand un compus colorat de la galben la rosu maroniu. Acidul amino-nitrosalicilic format se determina colorimetric. Deoarece oxidarea hidratilor de carbon nu are loc stoechiometric se va construi o curba etalon pentru glucoza.

Reactivi

• Hidroxid de sodiu 10%
• Tartrat de sodiu si potasiu 1,06M : se cantaresc 74,783 g tartrat de Na si K*4H₂O si se aduc la 250 ml cu apa distilata.
• Hidroxid de sodiu 0,4N : se cantaresc 4 g NaOH si se aduce la balon cotat de 250 ml cu solutie de tartrat de Na si K 1,06M
• Solutie de acid 3,5 dinitrosalicilic (DNS) 0,04M : se cantaresc 0,9130 g DNS, se dizolva in solutie de NaOH 0,4N in tartrat de Na si K, se aduce la 100 ml si se omogenizeaza.

Modul de lucru

Intr-o eprubeta cu peretii grosi se pipeteaza 2 ml din proba de analizat filtrata si in alta similara 2 ml din filtratul de la proba martor sau apa distilata ( dupa caz). Se aduc la pH 8,4-8,5 cu 4-5 picaturi NaOH 10% si se adauga 2 ml DNS in fiecare eprubeta. Se agita si se introduc eprubetele la care s-au atasat dopuri de vata sau de pluta intr-o baie de apa la fierbere timp de 10 minute. Dupa racire continutul eprubetelor se aduce la volumul de 10 ml cu apa distilata si se omogenizeaza. Se determina extinctia la un fotocolorimetru la lungimea de unda de 535 nm folosind cuva de 1 cm si apa distilata ca fond.

Trasarea curbei etalon

Pentru stabilirea curbei etalon se foloseste o solutie stoc de glucoza sau alt glucid reducator ( depinde de ce se analizeaza ) in concentratie de 0,1%. Din aceasta solutie se pipeteaza intr-o serie de eprubete in care se gasesc cate 2 ml reactiv DNS urmatoarele cantitati in ml: 0,0; 0,1; 0,2; 0,3; 0,4; 0,5; 0,6; 0,7; 0,8; 0,9; 1,0. Volumul eprubetelor se aduce cu apa distilata la 4 ml iar tratamentele ulterioare si adaugarea reactivilorse fac in modul descris la determinarea glucidului reducator in proba de cercetat. Dupa determinarea extinctiilor se scade valoarea extinctiei probei etalon de zero din valoarea extinctiilor celorlalte etaloane.Se traseaza curba etalon trecand pe abscisa cantitatile de zahar reducator iar pe ordinata extinctiile corespunzatoare.

Modul de calcul

Din valoarea extinctiilor probei de nalizat (E_p) se scade valoarea extinctiei probei martor (E_m). Se obtine:

E = E_p - E_m

In functie de aceasta diferenta se ia din curba etalon cantitatea de zahar reducator ce corespunde volumului de proba luat in analiza. Rezultatul se exprima in procente de glucid reducator.

3. Dozarea enzimatica a glucozei cu o-dianisidina

Principiul metodei

Glucoza este oxidata la acid gluconic si peroxid de hidrogen sub actiunea catalitica a glucozoxidazei. Peroxidul de hidrogen oxideaza o-dianisidina, in prezenta peroxidazei, cu formarea unui produs colorat care poate fi colorimetrat la 436 nm. Cantitatea de colorant formata este proportionala cu glucoza oxidata.

glucozoxidaza

b-D-glucoza +H₂O + O₂ acid gluconic + H₂O₂

peroxidaza

H₂O₂ + DH₂ (o-dianisidina redusa) 2H₂O + D (o-dianisidina oxidata)

Reactivi si solutii

solutie tamponata de enzime: se dizolva 0,9947 g NaH₂PO₄ H₂O, 4,159 g Na₂HPO₄ 12 H₂O, 225 U peroxidaza, 1400 U glucozoxidaza in 150 ml apa distilata;

solutie de o-dianisidina hidroclorica 5mg/ml;

reactiv glucoza: se adauga 0,5 ml solutie de o-dianisidina la 50 ml solutie tamponata de enzime;

solutie standard de glucoza 91 mg/ml.

Modul de lucru

Se lucreaza in eprubete si se introduc: 1 ml reactiv glucoza, 0,2ml solutie de analizat. Amestecul se termostateaza la temperatura de 37^oC timp de 10 min dupa care se realizeaza inactivarea activitatii enzimelor prin adaosul a 5ml H₂SO₄ 50%.

Se citeste apoi extinctia la lungimea de unda l=436 fata de o proba martor in care se adauga apa distilata in locul solutiei de glucoza.

In paralel se realizeaza o curba standard in acelasi mod, utilizandu-se concentratii diferite din solutia de glucoza standard (pana la max 15mg glucoza/ml).

Modul de calcul

Curba de regresie liniara intre continutul de glucoza si absorbanta s-a realizat folosind programul Table curve 2D, obtinandu-se urmatoarea ecuatie de regresie:

E = 0,170 + 0,002 c

unde: - c - cantitatea de glucoza, mg;

- E - extinctia.

In cadrul acestor determinari temperatura de reactie este un factor foarte important, aceasta metoda de dozare enzimatica a glucozei fiind cea mai precisa datorita specificitatii enzimelor.

4. Metoda directa de numarare a drojdiilor cu ajutorul citometrelor

Citometrele sau camerele de numarat reprezinta lame de sticla prevazute cu trei platforme, dintre care platforma centrala este denivelata fata de celelalte doua cu 0,10,2 mm. Platformele sunt separate intre ele prin rigole de sticla. Pe platforma centrala este gravata o retea din linii perpendiculare care delimiteaza o anumita suprafata divizata, de catre linii, in microcelule de forma patratica.

Camera Thoma, frecvent folosita la numarare, prezinta gravate pe ambele parti ale platformei centrale cate o retea cu suprafata de 1 mm² divizata in 400 de microcelule elementare deci suprafata unei microcelule este de 1/ 400 mm².

Pentru numarare se executa un preparat umed plasand suspensia de celule pe suprafata retelei, se asaza lamela care, sprijinindu-se pe cele doua platforme laterale va delimita inaltimea stratului de lichid egala cu adancimea camerei (0,1 mm). Preparatul astfel obtinut se fixeaza in dispozitivul de prindere al platinei microscopului. Cu obiectiv de 40 si ocular de 10 se cauta imaginea retelei. In campul microscopic, la grosisment 400 se pot aduce prin deplasarea platinei grupe de cate 16 microcelule elementare in care se face numararea celulelor de drojdie. Se exclud de la numarare celulele care se afla cu mai mult de jumatate din suprafata celulei in exteriorul careului de 4x4 microcelule.Se fac numarari din mai multe campuri microscopice (minimum 10) si se calculeaza numarul mediu de celule dintr-o microcelula. (Dan, 1999)

Cunoscand suprafata unei microcelule, se calculeaza volumul sau, in cm³

( V= Sxh = 0,0025 x0,1x10^-3) si in functie de dilutia folosita la numarare se stabileste numarul de celule de drojdie dintr-un gram biomasa sau 1 cm³ suspensie (N) cu urmatoarea formula:

N = n x k x 1/V, unde:n - numarul mediu de celule dintr-o microcelula

k - coeficient de dilutie

V - volumul unei microcelule, in cm³

5.     Determinarea viabilitatii celulelor de drojdie cu albastru de metilen

Determinarea viabilitatii drojdiei se refera la aprecierea numarului de celule vii.

O suspensie de celule ( se cantareste 1 g biomasa, se aduce cu apa distilata intr-un balon cotat de 500 ml, se dizolva apoi se aduce la semn continutul balonului cu apa distilata) se amesteca in proportii egale cu o solutie diluata de albastru de metilen cu citrat ( albastru de metilen 0,01%, citrat de sodiu x 2H₂O 2%) si dupa 35 minute de repaus din ea se executa un preparat umed.

In preparatul microscopic umed, celulele vii apar necolorate in timp ce celulele moarte apar colorate in albastru. Coloratia diferentiata a celulelor se datoreaza reductazelor active din celulele vii, enzime capabile sa transforme albastrul de metilen (indicator redox) din derivatul colorat in leucoderivat incolor. In celulele moarte reductazele sunt inactive de aceea culoarea albastrului de metilen patruns in celula ramane neschimbata.

Se face numararea celulelor vii si moarte cu ajutorul unui citometru si se stabileste procentul de celule moarte. (Dan, 1999, Stoicescu)

6.     Determinarea continutului de substanta uscata a biomasei de drojdie reziduala

Principiul metodei

Metoda consta in determinarea cu ajutorul termobalantei a pierderilor de masa prin incalzirea probei la temperatura de 110⁰C.

Aparatura si materiale

• Termobalanta
• Tavita de aluminiu, penseta pentru manevrarea tavitei, bagheta de sticla

Modul de lucru

Se porneste termobalanta si se introduce tavita de aluminiu in aparat. Se face tara tavitei apasand tasta T. Cu bagheta de sticla se distribuie cat mai uniform si in strat subtire pe tavita o cantitate oarecare de biomasa pentru analizat. Se inchide capacul termobalantei si se apasa tasta X pentru inceperea programului de eliminare a apei din proba la temperatura de lucru de 110⁰C. Dupa avertizarea sonora ce indica finalul analizei, pe ecranul de afisare a termobalantei se citesc urmatoarele: continutul de substanta uscata in procente a probei analizate, temperatura de lucru si durata operatiei.

7.     Determinarea umiditatii probelor de drojdie reziduala

Principiul metodei : determinarea pierderii de masa prin incalzirea probei la temperatura de 120⁰C pana la masa constanta.

Aparatura si materiale

• Balanta analitica
• Etuva electrica termoreglabila
• Exicator
• Fiole de cantarire, spatula, bagheta, cleste metalic
• Alcool etilic 96%

Modul de lucru

Se cantaresc la balanta analitica 3-5 g drojdie cu precizie de 0,0001 g intr-o fiola de cantarire. Se adauga 1 ml alcool etilic 96% si se usuca apoi timp de 2 ore la temperatura de 120⁰C ( metoda rapida). Etuva trebuie sa fie incalzita la 120⁰C in momentul introducerii probei. Dupa uscare, fiola se raceste in exicator timp de 25-30 minute. Se cantareste la balanta analitica sui se introduce din nou fiola in etuva pentru 30 minute. Se raceste din nou in exicator si se repeta uscarea pana la masa constanta.

Modul de calcul

Umiditatea probei exprimata in procente se calculeaza cu urmatoarea formula:

, in care:

M₀ - masa fiolei goale, in g

M₁ - masa fiolei cu proba inainte de uscare, in g

M₂ - masa fiolei cu proba dupa uscare, in g

8.       Determinarea proteinelor prin metoda Kjeldahl

Toate formele de azot existente intr-un preparat biologic sau intr-un produs alimentar sunt cuprinse sub denumirea de azot total. Pentru determinarea azotului total frecvent se foloseste metoda Kjeldahl.

Principiul metodei

Substantele organice continute in produsul de analizat, prin fierbere cu acid sulfuric concentrat si in prezenta catalizatorilor se descompun eliberand elementele lor constitutive sub diferite forme. Dintre aceste elemente, azotul este transformat cantitativ in amoniac.

Amoniacul rezultat in urma mineralizarii reactioneaza cu acidul sulfuric aflat in exces formand sulfat de amoniu. Sulfatul de amoniu rezultat, in mediu puternic alcalin se scindeaza cu eliberarea amoniacului. Amoniacul eliberat este distilat prin antrenare cu vapori de apa si captat intr-un volum cunoscut de acid sulfuric de o anumita concentratie legandu-se sub forma de sulfat de amoniu. Excesul de acid sulfuric este tratat cu o solutie de hidroxid de sodiu de aceeasi normalitate. Acidul sulfuric reactionat se calculeaza prin diferenta si serveste la determinarea procentuala a azotului total din proba.

Reactivi

• Acid sulfuric concentrat cu densitatea d = 1,84
• Acid sulfuric 0,1N
• Hidroxid de sodiu 0,1N
• Hidroxid de sodiu 33%
• Sulfat de cupru pulbere
• Sulfat de sodiu pulbere
• Indicator Rosu de Congo sau alt indicator

Modul de lucru

Determinarea azotului total prin aceasta metoda implica mai multe etape: mineralizarea, distilarea amoniacului, titrarea si calculul.

Mineralizarea

Intr-un balon Kjeldahl se introduc 1-2 g proba cantarita cu o precizie de 0,0001 g la balanta analitica. Se adauga 0,5 g catalizator, 20 ml H₂SO₄ concentrat si se asaza o palnie la gatul balonului. Balonul se monteaza intr-un stativ metalic sub nisa pe sita metalica si se incalzeste la flacara unui bec de gaz, treptat. In decursul primelor minute de mineralizare continutul balonului devine negru si spumos. In general, mineralizarea se considera terminata cand lichidul din balon s-a decolorat si a devenit transparent. Dupa racirea balonului Kjeldahl se adauga cu pipeta in acest balon 50-100 ml apa distilata, se omogenizeaza, se trece cantitativ intr-un balon cotat de 250 ml, se aduce la semn cu apa distilata, se omogenizeaza si se iau pentru distilare 25 ml.

Distilarea

Distilarea se efectueaza intr-un aparat numit Parnas-Wagner compus dintr-un balon de distilare, un deflegmator, un refrigerent cu alonja si generator de vapori. Solutia de analizat se introduce in balonul de distilare apoi la capatul refrigerentului se monteaza un vas conic in care se introduc 10 ml H₂SO₄ 0,1N, indicator si o cantitate de apa distilata astfel ca alonja sa patrunda cu 1-2 cm in solutia de prindere a distilatului.Dupa ce vasul de prindere a distilatului a fost montat, in balonul de distilare se introduc 20 ml NaOH 33% dupa care intreaga instalatie se etanseaza pentru a evita pierderile de amoniac. Distilarea se considera terminata atunci cand o picatura de distilat nu mai da reactie alcalina cu hartia rosie de turnesol.In acest caz alonja este spalata cu portiuni mici de apa distilata care sunt prinse in vasul conic.

Titrarea

Prin titrarea distilatului cu solutie de NaOH 0,1N se determina excesul de H₂SO₄.

Calculul

Cantitatea de azot total se calculeaza cu relatia:

, in care:

V₁ - volumul de H₂SO₄ 0,1N adaugat initial, in ml

V₂ - volumul de NaOH 0,1N cu care se titreaza excesul de H₂SO₄ 0,1N, in ml

M - masa probei luata pentru analiza, in g

d - dilutia efectuata

0,0014 - titrul H₂SO₄ 0,1N in raport cu azotul, in g/ml (0,0014= g azot care corespund la 1ml H₂SO₄ 0,1N)

Pentru a exprima rezultatul in substante proteice, cantitatea de azot calculata se inmulteste cu 6,25 deoarece la 1g azot corespund 6,25 g proteine tinand cont ca in proteine continutul mediu de azot este de 16%.

9.       Determinarea cenusii din drojdie

Principiul metodei

Metoda se bazeaza pe calcinarea rapida a produsului cu acetat de magneziu la temperatura de 600 - 650⁰C.

Reactivi

• Acetat de magneziu, solutie alcoolica

Modul de lucru

Intr-un creuzet de portelan cu diametrul de circa 3 cm, calcinat in prealabil pana la masa constanta se introduc 2-3 g produs si se cantareste cu precizie de 0,0001g. Peste produsul din creuzet se adauga 3 ml solutie alcoolica de acetat de magneziu in asa fel incat solutia sa se raspandeasca uniform pe toata suprafata produsului. Se lasa in repaus 1-2 minute dupa care se aprinde alcoolul cu flacara de la gaz. Dupa ce alcoolul a ars, se introduce creuzetul la gura cuptorului electric incalzit in prealabil la 600- 650⁰C.

Dupa carbonizare, creuzetul se introduce in cuptor, se inchide usa si se continua calcinarea la 600-650⁰C pana la disparitia carbunelui format. Calcinarea este terminata dupa 4 ore. Dupa calcinare, creuzetul se scoate din cuptor, se introduce intr-un exicator si se cantareste dupa ce s-a racit la temperatura camerei ( dupa 30 minute).

In paralel se determina masa oxidului de magneziu existenta in solutia de acetat de magneziu. Pentru aceasta, in 2 creuzete calcinate in prealabil pana la masa constanta se introduc 3 ml solutie alcoolica de acetat de magneziu. Se evapora cu atentie alcoolul apoi se calcineaza si se cantareste.

Modul de calcul

Continutul de cenusa raportat la substanta uscata se stabileste cu relatia:

, in care:

M - masa cenusii, g

m - masa oxidului de magneziu din solutia utilizata, g

M₁ - masa de produs luata in analiza,  g

U - umiditatea produsului, g

10. Determinarea beta- glucanilor din drojdie cu ajutorul kit-ului

Principiul metodei

1,3:1,6-β-D-Glucanul, 1,3- β-D-glucanii si α-glucanii sunt solubilizati in acid clorhidric concentrat ( HCl 37%; 10N ) si apoi extensiv hidrolizati cu HCl 1,3N la 100⁰C timp de 2 ore. Hidroliza la D- glucoza este completata prin incubare cu un amestec foarte pur de exo-1,3- β- glucanaza si β- glucozidaza. In timp ce unii β-glucani se solubilizeaza cu usurinta in apa sau hidroxid de potasiu fierbinte altii nu se solubilizeaza in aceste conditii. Analiza acestora necesita inainte o hidroliza partiala pentru a indeparta proprietatile de formare a gelului si legaturile covalente cu alte polizaharide (exemplu chitina) sau proteine.

Reactivii furnizati in kit

Sticla 1 : exo-1,3- β- glucanaza (100U/ ml) plus β- glucozidaza (20U/ml) suspensie, 2 ml. Stabila 4 ani la 4⁰C.

Sticla 2 : Amiloglucozidaza (1630U/ml) plus invertaza (500U/ml) solutie in glicerol 50% v/v , 20 ml. Stabila ~ 2 ani la 4⁰C sau 4 ani la -20⁰C.

Sticla 3 : Solutie tampon de glucoza ( concentrat 50 ml). Stabila ~ 2 ani la 4⁰C sau 4 ani la -20⁰C.

Sticla 4 : Reactiv de determinare a glucozei Concentratia reactivilor dupa dizolvare in solutie tampon:

- glucozoxidaza> 12.000 U / litru

- Peroxidaza> 650 U / litru

- 4- Aminoantipirina0,4 mM

Stabila pentru > 4 ani la - 20⁰C.

Sticla 5 : Solutie standard de D-glucoza ( 5ml, 1mg/ml) in acid benzoic 0,2% w/v. Stabila > 4 ani la temperatura camerei.

Sticla 6 : Preparat de β- glucan pentru controlul drojdiei (~ 2g, continut de β-glucan scris pe eticheta )

Stabila pentru > 5 ani la temperatura camerei.

Prepararea solutiilor sau a suspensiilor de reactivi furnizati

1. Se adauga 8 ml de solutie tampon de acetatt de sodiu 200mM (pH 5,0) la sticla 1 (se dilueaza continutul flaconului la 10 ml).Se imparte continutul in mai multe parti de marimi apropiate si se depoziteaza in tuburi de polipropilena la temperatura de -20⁰C intre utilizari si in gheata in timpul utilizarii. Odata diluat reactivul este stabil mai mult de 2 ani la -20⁰C.

2. Continutul sticlei 2 se foloseste ca atare.

3. Se dilueaza continutul sticlei 3 pana la 1 l cu apa distilata sau deionizata. Stabil > 2 ani la 4 ⁰C.

4. Se dizolva continutul sticlei 4 in continutul diluat al sticlei 3. Se divide acest amestec (GOPOD reactiv) in mai multe parti cu volumele dorite. Stabil 2-3 luni in cutii inchise la culoare la 4 ⁰C sau > 12 luni la -20⁰C.

5. Continutul sticlei 5 se foloseste ca atare.

6. Continutul sticlei 6 se foloseste ca atare.

Reactivi nefurnizati in kit

1. Solutie tampon de acetat de sodiu ( 200mM, pH 5,0 )

Se adauga 11,6 ml de acid acetic glacial (1,05g/ml) la 900 ml apa distilata si se ajusteaza la pH 5 folosind solutie de hidroxid de sodiu 4M (16 g/100ml). Se ajusteaza volumul la 1 l.

2. Solutie tampon de acetat de sodiu ( 1,2 M, pH 3,8 )

Se adauga 69,6 ml acid acetic glacial (1,05 g/ml) la 800 ml apa distilata si se ajusteaza la pH 3,8 folosind NaOH 4M. Se aduce volumul la 1 l cu apa distilata.

3. Hidroxid de potasiu (2M)

Se adauga 112 g KOH la 800 ml apa distilata si se dizolva prin agitare. Se ajusteaza volumul la 1 l.

4.     Acid clorhidric ( 37/v/v; 10M )

Modul de lucru

A.      Masurarea glucanului total ( α-glucan + β- glucan) plus D-glucoza din oligozaharide, zaharoza si D-glucoza libera

a) Solubilizarea si hidroliza partiala a glucanului total ( α-glucan + β- glucan) plus D-glucoza din oligozaharide, zaharoza si D-glucoza libera

1. Proba de drojdie macinata se trece prin sita de 0,5 mm folosind o moara centrifugala sau ceva similar.

2. Se adauga proba macinata (aproximativ 100mg cantarita exact) la un tub de 20x125 mm. Se atinge tubul pentru a te asigura ca toata proba este pe fundul acestuia.

3. Se adauga 1,5 ml HCl concentrat (37% v/v ) in fiecare tub, se acopera si se agita puternic la vortex. Se plaseaza tubul in baia de apa la 30⁰C timp de 45 minute si se agita apoi la vortex fiecare tub 15 minute pana la completa solubilizare a β- glucanului.

4. Se adauga 10 ml apa in fiecare tub, se acopera si se agita continutul pe vortex.

5. Se slabesc capacele si se plaseaza apoi in baie de apa la fierbere (100 ⁰C). Dupa 5 minute se strang capacele si se continua incubarea timp de 2 ore.

6. Se racesc tuburile la temperatura camerei, se desfac capacele cu grija si s eadauga 10 ml KOH 2N.

7. Se transfera cantitativ continutul fiecarui tub intr-un flacon volumetric de 100 ml folosind solutie acetat de sodiu tampon ( 200 mM, pH 5,0 ), se spala tubul si se ajusteaza volumul.Se amesteca meticulos prin inversare.

8. Se filtreaza o cota parte din fiecare suspensie prin hartie de filtru sau se centrifugheaza la 1500 g timp de 10 minute.

b) Masurarea glucanului total ( α-glucan + β- glucan) plus D-glucoza din zaharoza si D-glucoza libera

1. Se transfera o,1 ml parti ( in duplicat ) din extract pe fundul unei eprubete ( 16x100 mm)

2. Se adauga 0,1 ml amestec de 1,3 β- glucanaza () 20 U/ml) si β- glucozidaza (4U/ml) in tampon acetat pH 5,0 pe fundul fiecarui tub, se agita pe vortex si se incubeaza la 40⁰C timp de 60 minute.

3. Se adauga 3 ml amestec de glucozoxidaza si peroxidaza ( GOPOD) in fiecare tub si se incubeaza la 40⁰C timp de 20 minute.

4. Se masoara absorbanta fiecarei solutii la lungimea de unda 510 nm fata de proba martor.

B.       Masurarea α-Glucanului (glicogen si amidon) plus D-glucoza din zaharoza si D- glucoza libera

1. Se aduce proba macinata ( aproximativ 100 mg exact cantarita ) in tub de 20x125 mm astfel inncat sa fie toata proba pe fundul tubului.
2. Se adauga o bara magnetica (5x15 mm) apoi 2 ml HOH 2M in fiecare tub, se suspenda peletii si se dizolva glicogenul si amidonul.prin agitare 20 minute intr-o baie de apa cu gheata pe un agitator magnetic.
3. Se adauga 8 ml tampon acetat pH 3,8 in fiecare tub cu agitare. Imediat se adauga 0,2 ml amiloglucozidaza (1630U/ml) plus invertaza (500U/ml), se agita bine si se plaseaza tubul intr-o baie de apa la 40⁰C.
4. Se incubeaza tubul la 40⁰C pentru 30 minute cu amestecare intermitenta pe vortex.

5.a Pentru probe cu mai mult de 10% α-glucan se transfera cantitativ in balon cotat de 100 ml folosind o sticla cu apa de spalare si se ajusteaza volumul cu apa distilata. Se agita bine. Se centrifugheaza o cota parte la 1500 g timp de 10 minute sau se filtreaza.

5.b Pentru probe cu mai putin de 10% α-glucan direct se centrifugheaza tubul la 1500 g timp de 10 minute fara diluare. Pentru fiecare proba volumul final in tub este ~ 10,3 ml (totusi acest volum poate varia putin cu tipul de proba analizata). In acest caz o apropiata cota pentru volum va fi folosita in calcule.

6. Se transfera 0,1 ml cota parte in duplicat din fiecare supernatant diluat sau nediluat intr-un tub (16x100mm), se adauga 0,1 ml de solutie tampon de acetat de sodiu pH 5,0 plus 3 ml reactiv GOPOD si se incubeaza la 40⁰C pentru 20 minute.

7. Se masoara absorbanta fiecarei solutii la 510 nm fata de proba martor.

Proba martor consta in 0,2 ml solutie tampon de acetat de sodiu pH 5,0 plus 3 ml reactiv glucozoxidaza si peroxidaza.

Proba de D-glucoza standard consta in 0,1 ml D-glucoza standard (1mg/ml) plus 0,1 ml solutie tampon de acetat de sodiu pH 5,0 plus 3 ml reactiv glucozoxidaza si peroxidaza.

Mod de calcul

β- Glucan = Total Glucan - α-Glucan

(+ oligomeri, etc) (+ oligomeri, etc)

(+ oligomeri, etc)

(+ oligomeri, etc)

(+ oligomeri, etc)

unde:

∆E = absorbanta probei de analizat - absorbanta probei martor

F = factor de conversie a absorbantei la μg D-glucoza

100/0,1 = factor de corectie al volumului pentru glucan total (0,1 ml adus la 100ml)

103 = factor de corectie al volumului pentru α-glucan (0,1 ml adus la 10,3 ml)

Sau

1000 = factor de corectie a volumului pentru α-glucan (0,1 ml adus dintr-un la 100 ml)

1/1000 = conversia de la μg la mg

100/W = conversia inapoi la 100 mg proba

W = masa probei analizate

162 / 180 = factor de conversie de la D-glucoza libera la β- glucan

11. Determinarea glicogenului din drojdie ( metoda Quain )

500 mg substanta uscata drojdie Incubare cu 50 ml carbonat de sodiu 0,25M la 1000C timp de 15 minute Racire Centrifugare Spalare cu 25 ml apa distilata Recentrifugare Supernatant Reziduu Se aduce la 100 ml cu apa distilata Resuspendare in 50 ml acid percloric 0,5M Se iau 10 ml si se ajusteaza la pH 5,0  Incalzire pe baie de apa la fierbere 10 min cu acid acetic 3M Racire Se aduce la 50 ml cu solutie tampon de acetat de sodiu 0,2M pH 4,8Centrifugare Incubare cu amiloglucozidaza (1,4U) Spalare cu acid percloric 0,5M 2 h la 370C Recentrifugare Neutralizare cu solutie tampon KOH Se aduce supernatantul la 250 ml Determinarea enzimatica a glucozei cu apa distilata Se iau 10 ml si se ajusteaza la pH 5,0 cu hidroxid de amoniu 4% v/v Se aduce la 50 ml cu solutie tampon de acetat de sodiu 0,2M pH 4,8 Incubare cu amiloglucozidaza (70U 2 h la 370C Neutralizare cu solutie tampon KOH Determinarea enzimatica a glucozei

12. Metoda de preparare a β- Glucanului (Jordan)

Drojdie uscata Dispersare in solutie NaOH 3% Incalzire directa pana la fierbere. Repaus peste noapte cu decantare Inlaturare supernatant Repetare digestie cu NaOH de doua ori Adaugare HCl 2,45M la reziduu Incalzire directa pana la fierbere. Repaus peste noapte cu decantare Inlaturare supernatant Repetare digestie de doua ori cu HCl 1,75M respectiv 0,94M Adaugare apa distilata la reziduu si amestecare Incalzire directa pana la fierbere. Repaus peste noapte cu decantare Inlaturare supernatant Repetare spalare cu apa pana cand reziduul devine alb si floculent Adaugare alcool etilic absolut la reziduu Incalzire directa pana la fierbere. Repaus peste noapte cu decantare Inlaturare supernatant Repetare extractie cu alcool etilic pana cand supernatantul devine colorat Adaugare apa distilata la reziduu si amestecare Incalzire directa pana la fierbere. Repaus peste noapte cu decantare Inlaturare supernatant Repetare spalare cu apa Cernere glucan rezultat prin sita fina Congelare si liofilizare pana la uscare Glucan

13. Metoda de preparare a β- Glucanului (Jamas)

Drojdie suspensie Centrifugare la 8000 rpm timp de 20 minute Spalare cu apa distilata de doua ori Resuspendare biomasa in solutie NaOH 4% Incalzire la 1000C timp de 1h cu agitare puternica Centrifugare la 2000 rpm timp de 15 minute Resuspendare sediment in solutie NaOH 3% Incalzire la 750C timp de 3h cu agitare puternica Racire la temperatura camerei si repaus 16 ore Centrifugare la 2000 rpm timp de 15 minute Extractie in solutie NaOH 3% la 750C timp de 1h dupa aducere la pH 4,5 cu HCl Centrifugare si spalare cu apa de trei ori Spalare cu etanol o data si cu eter etilic de doua ori Uscare suspensie la 370C timp de 12 h pana se obtine pulbere fina Determinare puritate glucan

14. Metoda de hidroliza a produselor cu glucani (Dallies)

Produs derivat din drojdie 1,5 mg Hidroliza cu 50 µl H2SO4 72% timp de 3 h la 250C Adaugare apa distilata 650 µl ( se obtine H2SO4 1M) si incubare la 1000C timp de 3h Adaugare apa distilata 3 ml Precipitare sulfat si neutralizare cu solutie Ba(OH)2 40g / l Centrifugare Determinare glucoza

15. Metoda de hidroliza a produselor cu glucani (Francois)

Produs derivat din drojdie 10 mg Hidroliza cu 75 µl H2SO4 72% timp de 3 h la 200C - 250C Adaugare apa distilata 0,95 ml si incubare la 1000C timp de 4 h Adaugare apa distilata 2,5 ml si transfer in flacon de 50 ml Spalare cu apa distilata 2,5 ml de doua ori Neutralizare cu solutie saturata de Ba(OH)2 40g / l Repaus peste noapte la 40C Adaugare apa distilata pana la volum constant Centrifugare la 4800 g timpde 15 minute la temperatura de 40C Transfer in tuburi eppendorf Centrifugare la 8000 g timp de 5 minute la temperatura de 40C Determinare glucoza

16. Tratamente fizice pentru ruperea peretelui celular

a. Mojararea

Aceasta metoda s-a aplicat folosind nisipul cuartos ca agent abraziv si mojarul cu pistil ca vas de laborator. Schema de lucru a fost urmatoarea:

20 g drojdie ( 20% s.u.) 20 g nisip Omogenizare Mojarare timp de 20 minute Repaus peste noapte in frigider Adaugare 20 ml apa Centrifugare la 3300 rpm timp de 20 minute Supernatant Sediment

b. Congelarea - decongelarea

Acest tratament s-a aplicat sub forma a cinci congelari si decongelari succesive cu scopul formarii de cristale de gheata care sa duca la ruperea peretelui celular. Congelarea s-a realizat la temperatura de -70⁰C timp de 20 minute utilizand un congelator tip "Ultrafreezer Platinum 500 V Plus". Decongelarea a durat de fiecare data 40 minute si s-a desfasurat la temperatura camerei. Dupa ultima decongelare proba a fost centrifugata la turatia de 3300 rpm.

c. Ultrasonarea

Tratamentul cu ultrasunete s-a realizat prin introducerea unei suspensii de drojdie ( raport 1:1 drojdie - apa ) intr-o baie ultrasonica tip " Ultrasonic Cleaner SONICA " la 45 Khz timp de 20 minute conform schemei :

20 g drojdie 20 ml apa Omogenizare Tratament la rece pe baie de gheata Centrifugare 3300 rpm timp de 20 minute SupernatantSediment

d. Tratamentul prin soc termic

Tratamentul prin soc termic favorizeaza eliberarea de substante din celula modificand permeabilitatea peretelui celular. S-au aplicat doua variante conform schemelor de lucru:

20 g drojdie 20 ml apa Omogenizare Incalzire la 700C si mentinere 1 minut Racire rapida la temperatura camerei Centrifugare 3300 rpm , 20 minute SupernatantSediment

20 g drojdie 20 ml apa la 1000C Omogenizare Mentinere pe baie de apa la fierbere 1 min Racire rapida la temperatura camerei Centrifugare 3300 rpm , 20 minute SupernatantSediment

e. Plasmoliza

Tratamentul prin plasmoliza s-a aplicat utilizand ca agenti plasmolizanti sarea in concentratie de 3% respectiv 6% fata de drojdie si zaharul in proportie de 20 % fata de drojdie. Biomasa de drojdie s-a omogenizat cu agentul plasmolizant. Schema de lucru a fost cea de mai jos:

20 g drojdie Agent plasmolizant : NaCl 3%, NaCl 6%, zahar 20% Omogenizare Repaus la temperatura camerei 1 h Diluare cu 20 ml apa Centrifugare Supernatant Sediment

f. Tratamentul chimic (alcalin)

In tratamentul chimic s-a folosit solutie de NaOH 1N dupa urmatoarea schema:

20 g drojdie 10 ml H2O Omogenizare Alcalinizare la pH 9,5-10 cu NaOH 1N Diluare cu 8 ml H2O Agitare la temperatura camerei 15 minute Centrifugare Supernatant Sediment

g. Autoliza

Un procedeu de degradare a celulei si de eliberare a componentilor il constituie liza cu enzime endogene ale celulei, proces numit autoliza. Schema de lucru aplicata a fost:

20 g drojdie 10 ml H2O Omogenizare Acidulare la pH 5 cu HCl 1N Termostatare la 500C timp de 24 h cu agitare Acidulare la pH 3,5 cu HCl 1N Termostatare la 600C timp de 24 h cu agitare Adaugare 10 ml H2O si omogenizare Centrifugare SupernatantSediment

h. Fragmentarea drojdiei cu moara cu bile

Biomasa de drojdie reziduala (18% s.u.) cu apa in proportie de 1:1 a fost macinata timp de 15-20 minute (cu intermitente) la frecventa de 25 sau 30 Hz cu 3,4,5 bile din otel inoxidabil de diametre: 5,9,12 mm utilizand o moara cu bile " Mixer Mil Type MM 301".

17. Determinarea glucanilor ca fibre alimentare

Folosind , cu unele modificari metoda AOAC de determinare a fibrelor totale din produsele de panificatie s-a determinat continutul de glucani din drojdia reziduala liofilizata sau umeda (suspensie) utilizand aparatul "Fibertec FOSS Tecator apparatus 1023 E". Metoda a constat in urmatoarele operatii:

1 g proba de drojdie uscata sau liofilizata Amestecare cu 30 ml solutie tampon TRIS , pH 8 Adaugare 0,5 g enzima α- amilaza (Tenaza) Mentinere pe baie de apa la 800C timp de 30 minute Reglare pH =5,5 cu HCl 2% Adaugare 0,3 g enzima Amiloglucozidaza Mentinere pe baie de apa la 600C timp de 30 minute Adaugare 1 ml enzima pepsina Mentinere pe baie de apa la 500C timp de 30 minute Adaugare 20 ml etanol 96% si mentinere 20 minute Adaugare crucibil plus 0,5 g celita la vasul cu proba si fixare la aparat Filtrare Uscare la etuva crucibil plus celita plus proba remanenta pana la masa constanta Calculare masa glucani

Mod de calcul

unde:

TDF = fibre alimentare totale, %

m₂ = masa crucibil + celita + depozit, g

m₁ = masa crucibil + celita, g

x= continut de proteine, g

y= continut de cenusa, g

p= masa probei de analizat, g

18. Procedeu de dezamarare a biomasei de drojdie reziduala

Drojdie reziduala lichida Centrifugare la 3300 rpm timp de 15 minute Pasta de drojdie Supernatant Spalare cu apa canal timp de 30 minute la 300C Centrifugare la 3300 rpm timp de 5 minute Pasta de drojdie Supernatant Spalare cu solutie Na2CO3 1,3% timp de 20 minute la 300C Centrifugare la 3300 rpm timp de 5 minute Pasta de drojdie Supernatant Spalare cu solutie Na2CO3 2 % timp de 20 minute la 300C Centrifugare la 3300 rpm timp de 5 minute Pasta de drojdie Supernatant Spalare cu apa canal rece (120C ) timp de 30 minute la 300C Pasta de drojdie Supernatant ( ape de spalare)

19. Determinarea vascozitatii beta - glucanilor

Pentru studiul vascozitatii beta - glucanilor s-a folosit solutie de cazeinat de sodiu 1% (50 g) si ulei comestibil (140 g) pentru proba martor.Aparatul utilizat a fost reotestul