|
|
|
PRINCIPII DE GENETICA IN DIAGNOSTIC, TRATAMENT SI PROFILAXIE
1. Principii de genetica de diagnostic
Particularitati
diagnosticul componentei ereditare a unei boli se impune cat mai precoce
F in medicina: preconceptional, prenatal, postnatal, presimptomatic
F in epidemiologie - ore // zile de la eveniment
F in criminalistica - ore // zile // ani - de la eveniment
F in medicina legala - ????
diagnosticul componentei ereditare nu incepe si se termina cu bolnavul
F punct de plecare pentru investigarea intregii familii
1.1. Diagnosticul genetic clinic = pasul initial = bolnavul se prezinta la practician
1.2. Diagnosticul genetic paraclinic
A) prin tehnici invazive
Fetoscopia = vizualizarea fatului //placentei // cordonului ombilical
permite diagnosticul malformatiilor congenitale
permite terapia fetala
rar utilizata - risc de avort = 5%
Amniocenteza = punctia tansvaginala // transabdominala a cavitatii amniotice
prelevare 5-10ml proba investigatii citogenetice, biochimice, ADN
investigatiile citogenetice = rezultat tardiv - celule imbatranite
risc mic pentru embrion
Biopsia de vilozitate coriala = prelevare sub control ecografic proba anexe fetale
risc relativ mediu pentru embrion
investigatiile citogenetice = rezultat precoce - celule tinere
Cordocenteza = prelevare de sange embrionar din cordonul ombilical
risc mare pentru embrion utilizata in situatii speciale
B) prin tehnici neinvazive
Ecografia fatului = examen de rutina ce permite
evaluare greutate si dimensiuni fetale
prognosticul datei nasterii
diagnosticul sex fat // malformatii congenitale
Radiografia fetala
efectuata numai in bolile ereditare ale sistemului osos
1.3. Diagnosticul citogenetic
Testul Barr - diagnosticul anomalii numerice gonozomiale (cromosom X)
Cariotipul simplu - diagnosticul anomaliilor cromosomiale numerice
Cariotipul prin marcaj in benzi (bandarea cromosomilor) - tehnicile G, Q, R
permite diagnosticul anomaliilor cromosomiale structurale
1.4. Diagnosticul genetic biochimic
Evidentierea acumularii de substrate / produse metabolice anormale
ex. = Fen - r. cu perclorura de fier, t. Guthrie, hartie Fenistix
Separarea cromatografica a unor substrate
ex. = aminoacizii (aminoacidopatii) + colorare cu ninhidrina
F alifatici (albastru), aromatici (maro), imidazolici (roz)
Separarea electroforetica a polipeptidelor
ex. = hemoglobinopatii, izoenzime etc
Teste enzimatice = diagnostic
homozigoti recesivi (afectati)
heterozigoti (purtatori)
homozigoti dominanti (normali)
Teste imunologice = markeri - antigene de histocompatibilitate (haplotipuri)
dg. presimptomatic, dg. purtatori, dg. paternitate, eval. risc
Dozarea nivelului umoral al unui produs biologic
ex. = factorii de coagulare
Secventare proteina = evidentiere a.a. mutant (nu detecteaza mutatiile sinonime)
ex. = bolile moleculare
1.5. Diagnosticul genetic molecular (analiza ADN)
Sursa ADN = orice celula nucleata 10ml de sange 300μg ADN
Analiza ADNN
dg. genetic indirect = sonde ADN // loci polimorfi // secvente repetitive // PCR
dg. genetic direct = secventare alela mutanta //ASOs // PCR
1.5.1. Diagnosticul indirect prin tehnici de genetica moleculara
Metoda - variabilitatea secventelor AND - detectarea unei alele mutante
F polimorfismul lungimii fragmentelor de restrictie (RFLPs)
F variabilitatea numarului de secvente repetitive (VNTRs)
A. RFLPs
Enzime de restrictie
celule procariote = aparare contra ADN strain > 400 enzime
F recunosc peste 100 secvente diferite cu lungimi de 4-6pb
F taie ADN in fragmente de lungimi diferite
F identificare fragmente - proba (antisecventa) ADN marcata
RFLPs - determina prezenta / absenta siturilor restrictie
20% indivizi - variatii situri de restrictie = polimorfism genetic
F survin la ~ 200-500pb in genomul uman
F majoritatea fara expresie fenotipica (clinica) = mutatii tacute
F numai 1/6-1/5 pot fi identificate prin enzime de restrictie
B. VNTRs = secvente repetitive = microsateliti / minisateliti / oligonucleotide
F numarul de secvente repetitive difera intre omologi (70%)
F detectarea simultana a unor loci multipli = amprenta ADN
F utilitate: medicina, medicina legala, criminalistica
VNTRs - secvente microsatelit F prezente la cca. 30Kb, lungime < 1Kb
VNTRs -secvente minisatelit F lungime 1-3Kb
STR (small tandem repeats) - secvente inalt repetitive
Tehnici pentru identificarea polimorfismului ADN
Southern blotting - necesita 5-10μg ADN - rezultate - 1 saptamana
taiere ADN in situri de restrictie
separare fragmente prin electroforeza
transfer fragmente pe un filtru de celuloza
identificarea secventei dorite cu o antisecventa marcata
PCR - necesita 50ng ADN - rezultate - o zi
amplificare prin replicare a unui fragment de AND
F in 20-30 runde = amplificare de 105
digestia fragmentului cu enzime de restrictie
separarea fragmentelor prin electroforeza
coloraea fragmentelor cu bromura de etidiu, florocromi
vizualizare cu UV
1.5.2. Diagnosticul direct prin tehnici de genetica moleculara
permite diagnosticul molecular exact
Southern blotting + PCR
permite detectarea mutatiilor genice
F deletii = benzi micsorate sau absente
F amplificare trinucleotide = benzi mai late
Oligonucleotidele specifice alelelor (ASOs)
identificate prin probe complementare pentru ADN normal / mutant
prezenta / absenta hibridizarii poate identifica indivizii
F homozigoti normali
F heterozigoti (purtatori) normali
F homozigoti afectati
Secventarea ADN - utilizeaza o singura catena
sinteza oligonucleotide cu lungime crescanda
4 reactii paralele (capilare diferite)
1 capilar - marcarea nucleotidelor prin 4 florocromi diferiti
stopare polimerizare = adaos deoxinucleotide specifice
identificare oligonucleotid dupa pozitia pe gel (soft specializat)
citirea secventei pe gel / calculator
2. Principii genetice de tratament
Filiera dogmei centrale - tratamentul se adreseaza
substratului
F dieta de restrictie / imbogatire
F favorizarea eliminarii produsului toxic
F derivatii chirurgicale
produsilor genici
F terapie de substitutie
F transplant de tesuturi (maduva hematogena, fibroblaste)
genelor
F culturi de celule de la pacient
F sinteza gena prin revers-transcriptaza
F constituire banca de gene - pe plasmide
F transfer de gene in culturi de celule
F selectare celule ce au fixat gena normala
F transfer celule in organism
-1. Limitarea substratului = dieta
In bolile cu deficit de enzime pe caile catabolice
fenilcetonurie - galactozemie - deficit de lactoza etc
-2. Indepartarea unui produs metabolic ce se acumuleaza
Indepartarea medicamentoasa - in boala Wilson - cu D-penicilamina
Indepartarea prin dializa - in cistinurie pentru a preveni litiaza
Inductia enzimatica a enzimelor RER - in s. Crigler-Najar - glicuronil transferaza
-3. Administrarea produsului deficitar
Suplimentarea proteinei deficitare
STH, T-3, cortizon, aldosteron, hormoni sexuali, insulina, facori coagulare etc.
Tratamentul de substitutie = deficit total / partial de enzime - in tezaurismoze, MPZ
-4. Tratamentul chirurgical
Tratamentul chirurgical de rutina = corectare, estetic, preventiv
malformatii, extirpare tumori etc
Chirurgia pe uter deschis = malformatii - pericol vital in perioada neonatala
hidrocefalie, obstructie cai urinare, hernie diafragmatica etc.
Transplant tesuturi // organe cornee, timus, rinichi, pancreas, maduva hematogena
-5. Terapia genica
Transfer de gene in culturi de celule prin vectori virali
tropism pentru un tip celular
defectiv - sa nu produca boala
insertie gena in pozitia normala // apropiat
3. Principii genetice de profilaxie
profilaxia - justificat de costurile sociale
Ancheta familial - pornind de la proband
Identificare heterozigoti - inainte de cstorie in familiile cu risc genetic
Screening familial pentru o boala + diagnostic presimptomatic
Diagnostic prenatal - ecografic, citogenetic, biochimic, molecular
Sfat genetic - candidatilor la casatorie // parintilor cu istoric familial
Inseminare artificiala - sot cu boala dominanta // oligo/azoospermie
Fecundarea in vitro - sotie cu boala dominanta
sincronizare ciclu donatoare (sanatoasa) + acceptoare (afectata)
recoltare ovul prin aspirare
fertilizare prin ICSI
pastrare embrion in cultura pana la stadiul de blastocist
transfer zigot la mama-acceptoare
Modificare mediu - educatie, evitare factori declansatori
Tratament profilactic - prevenire malignizare, agravare etc.
